Innenohrschwerhörigkeit und Otoferlin: Expressionsmuster und Basis zur funktionellen Analyse im Tiermodell
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| Veröffentlicht: |
Esslingen
Im Selbstverl.
2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Summary 1
Zusammenfassung 2
1. Einleitung 3
1.1 Entwicklung des Ohrs beim Säuger 4
1.2Otoferlin 5
1.3 Ziele der Arbeit 9
2. Material und Methoden 10
2.1 In silico Sequenzanalysen 10
2.2 Versuchstiere und deren Präparation 10
2.3 Expression und Lokalisation von Otoferlin 11
2.3.1 Herstellung von Kryo-Schnitten 11
2.3.2 PCR zur Generierung der Ribosonde und Überprüfung der Otoferlin-Expression 11
2.3.2.1 RNA-Isolation und cDNA-Synthese 11
2.3.2.2 Ribosonden-Synthese 12
2.3.2.3. Expressionsnachweis von Otoferlin mittels PCR 12
2.3.3 In situ Hybridisierung 12
2.3.4 Antikörper 13
2.3.5 Immunhistochemie 14
2.3.6. Western Blot 14
2.3.6.1 Proteinisolierung 14
2.3.6.2 Elektrophorese, Blot und Detektion 15
2.4. Generierung des „fcnocfc-/n -Konstrukts 16
2.4.1 PCR für das Screening einer Cosmid-DNA-Bibliothek 16
2.4.2 Restriktionsverdau derCosmide und Subklonierung der Fragmente 16
2.4.3 Mutagenese 17
2.4.4 Klonierung der Fragmente in den Selektionsvektor 18
2.4.5 Southern Blot 20
2.4.5.1 Sonden-Generierung 20
2.4.5.2 Elektrophorese, Blot und Detektion 20
3. Ergebnisse 25
3.1 Otoferlin 25
3.2 Lokalisation und Expression von Otoferlin 26
3.2.1 Nachweis der Otoferlin-Expression mittels RT-PCR 27
3.2.2 Lokalisation von Otoferlin 28
3.2.2.1 In situ Hybridisierung am Innenohr 28
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.2 Immunhistochemie am Innenohr 30
3.2.3 Lokalisation von Otoferlin vor und nach Hörfunktionsbeginn 31
3.2.4 Otoferlin - neuronale Expression 32
3.2.4.1 Neuronale Otoferiin-Expression in der Cochlea 32
3.2.4.2 Neuronale Otoferiin-Expression im Gehirn 34
3.2.5 Identifizierung und Charakterisierung des Proteins 36
3.2.5.1 Western Blot 36
3.3. Generierung des „*nocfc-/n -Konstrukts 38
3.3.1 Strategie 38
3.3.2 Mutagenese 40
3.3.3 Klonierung 42
3.3.4 Sequenzierung 45
3.3.4.1 Strategie zur Umklonierung 46
3.3.5 Southern Blot 47
4. Diskussion 49
4.1 Expression und Lokalisation von Otoferlin 51
4.1.1 Lokalisation von Otoferlin im Innenohr 51
4.1.2 Neuronale Expression von Otoferlin 52
4.1.3 Charakterisierung von Otoferlin mittels Western Blot 53
4.2 Mausmodell M
4.2.1 Strategie und Generierung der Fragmente für das „*noc/(-/n -Konstrulct 54
4.2.2 Southern Blot 57
4.3. Ausblick 57
Literaturverzeichnis 60
Internetreferenzen 62
Danke 63
Lebenslauf 64
II
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Summary 1
Zusammenfassung 2
1. Einleitung 3
1.1 Entwicklung des Ohrs beim Säuger 4
1.2Otoferlin 5
1.3 Ziele der Arbeit 9
2. Material und Methoden 10
2.1 In silico Sequenzanalysen 10
2.2 Versuchstiere und deren Präparation 10
2.3 Expression und Lokalisation von Otoferlin 11
2.3.1 Herstellung von Kryo-Schnitten 11
2.3.2 PCR zur Generierung der Ribosonde und Überprüfung der Otoferlin-Expression 11
2.3.2.1 RNA-Isolation und cDNA-Synthese 11
2.3.2.2 Ribosonden-Synthese 12
2.3.2.3. Expressionsnachweis von Otoferlin mittels PCR 12
2.3.3 In situ Hybridisierung 12
2.3.4 Antikörper 13
2.3.5 Immunhistochemie 14
2.3.6. Western Blot 14
2.3.6.1 Proteinisolierung 14
2.3.6.2 Elektrophorese, Blot und Detektion 15
2.4. Generierung des „fcnocfc-/n"-Konstrukts 16
2.4.1 PCR für das Screening einer Cosmid-DNA-Bibliothek 16
2.4.2 Restriktionsverdau derCosmide und Subklonierung der Fragmente 16
2.4.3 Mutagenese 17
2.4.4 Klonierung der Fragmente in den Selektionsvektor 18
2.4.5 Southern Blot 20
2.4.5.1 Sonden-Generierung 20
2.4.5.2 Elektrophorese, Blot und Detektion 20
3. Ergebnisse 25
3.1 Otoferlin 25
3.2 Lokalisation und Expression von Otoferlin 26
3.2.1 Nachweis der Otoferlin-Expression mittels RT-PCR 27
3.2.2 Lokalisation von Otoferlin 28
3.2.2.1 In situ Hybridisierung am Innenohr 28
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.2 Immunhistochemie am Innenohr 30
3.2.3 Lokalisation von Otoferlin vor und nach Hörfunktionsbeginn 31
3.2.4 Otoferlin - neuronale Expression 32
3.2.4.1 Neuronale Otoferiin-Expression in der Cochlea 32
3.2.4.2 Neuronale Otoferiin-Expression im Gehirn 34
3.2.5 Identifizierung und Charakterisierung des Proteins 36
3.2.5.1 Western Blot 36
3.3. Generierung des „*nocfc-/n"-Konstrukts 38
3.3.1 Strategie 38
3.3.2 Mutagenese 40
3.3.3 Klonierung 42
3.3.4 Sequenzierung 45
3.3.4.1 Strategie zur Umklonierung 46
3.3.5 Southern Blot 47
4. Diskussion 49
4.1 Expression und Lokalisation von Otoferlin 51
4.1.1 Lokalisation von Otoferlin im Innenohr 51
4.1.2 Neuronale Expression von Otoferlin 52
4.1.3 Charakterisierung von Otoferlin mittels Western Blot 53
4.2 Mausmodell M
4.2.1 Strategie und Generierung der Fragmente für das „*noc/(-/n"-Konstrulct 54
4.2.2 Southern Blot 57
4.3. Ausblick 57
Literaturverzeichnis 60
Internetreferenzen 62
Danke 63
Lebenslauf 64
II |
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