Parakrine Aktivierungsmechanismen der hepatischen Sternzellen durch Hepatozyten: ein Beitag zur präinflammatorischen Phase der Leberfibrogenese
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2005
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Marburg, Univ., Diss., 2005 |
| Beschreibung: | 183 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung.
1.1 Allgemeine Epidemiologie der Leberkrankheiten 1
1.2 Allgemeine Struktur des Leberparenchyms und zellulärer Aufbau 3
1.2.1 Hepatozyten, Parenchymzellen 4
1.2.2 nepalische Sternzellen (HSC, Ito-Zellen, perisinusoidale
Lipozyten, Vitamin A-Speicherzellen, hepatic stellate cells) 4
1.2.3 K.upfier-Zc!icn 9
1.2.4 Pil-Zellen (large granulär lymphocyles) 10
1.2.5 Endothelzellen 10
1.3 Die extrazelluläre Matrix der Leber 11
1.4 Wachstum-stimulierende Faktoren 14
1.5 Wachstum-inhibierende Faktoren 16
1.6 Leberfibrose 17
1.6.1 Die zellulären Komponenten der Leberfibrose 20
1.6.2 Die Rolle der Proteoglykane in der Leberfibrose 25
2. Material und Methoden.
2.1 Vii wendete Substanzen und ihre Fabrikate 29
2.2 Versuchstiere 32
2.3 Präparation und Isolierung der Zellen 32
2.3.1 Präparation und Isolierung der Parenchymzellen aus der Rattenleber 32
2.3.2 Präparation und Isolierung der HSC aus der Rattenleber 34
2.3.3 Präparation und Isolierung der Kupffer-Zellen aus der Rattenleber 36
2.3.4 Isolierung und Kultivierung von Hautfibroblasten der Ratte 37
2.4 Zellkulturen 39
2.4.1 Herstellung von Zellkulturmedien 39
2.4.2 Identifizierung und Reinheit der Kupffer-Zellen,HSC
und der Hepatozyten 39
2.4.3 Bestimmung der Zellzahl. Vitalität und Reinheit der Kulturen 41
2.4.4 Subkultivierung von Zellen in Monolayer Zellkultur 42
2.4.5 Präparation der Hepatozyten konditionierten Medien 43
2.4.6 Präparation des Hepatozyten-Lysats 43
2.5 Partielle Reinigung der mitogenen Aktivität des Hepatozyten-konditionierten
Mediums 44
2.5.1 FP1,C (fast protein liquid chromatography) 45
2.5.2 Gel-Permeationschromatographie 47
2.6 Charakterisierung der partiell gereinigten mitogenen Aktivität 49
2.6.1 Trypsinbehandlung 49
2.6.2 Überprüfung der Bindungsfahigkeit des mitogenen Faktors an HeparinSO
2.6.3 Hitzebeständigkeit des mitogenen Faktors 51
2.6.4 pH-Stabilität 51
2.6.5 Stabilität des mitogenen Faktors unter dem Einfluß
verschiedener chemischer bzw. organischer Substanzen 51
2.6.6 Behandlung mit reduzierenden Substanzen,
Proteinase-Inhibitor und Anti-TGF-a 52
2.7 Meßverfahren und Bestimmungsmcthoden 53
2.7.1 Fluometrische DNA-Bestimmune 53
2.7.2 Proteinbcstiininung nach Lowry 54
2.7.3 Proteinbestimmung für Membranproteine und
Proteine in außergewöhnlichen Puffern und Reagenzien 55
2.7.4 Bestimmung der [3H] hymidin-Inkorporation in die DNA der Zelle 56
2.7.5 Messung der Proteoglykan-Synlhescrale
in den Monolayer-Zellkulturen 57
2. / Optische Darstellung der Zellproliferation mittels
Bromodesoxy-Uridin Inkorporation 60
2.7.7 Immunfluoreszenzfärbung der zytoskelctalen Proleine
und Proteine der extrazellulären Matrix [Fibroneetin (a),Laminin (b),
Tenascin (c), Desmin (d), Vimentin(e), sm-u-Actin (0] 62
2.7.8 Europium verstärkter zeitabhängiger Ftuoreszenzimmunoassay
von zellgebundenem l ibronectin und Laminin 63
2.7.9 Arginase-Bestimmung 64
2.8 Ansäuerung des Kupfferzell-Mediums 66
2.9 Allgemeine Analyse-Verfahren 66
3. Ergebnisse.
3.1 Aussaatkriterien und Isolierung 67
3.!.! Allgemeine Bedingung 67
3.1.2 Allgemeine Ergebnisse der HSC-lsolierung 67
3.1.3 Allgemeine Ergebnisse der Hepatozyten-Präparation 68
3.1.4 Allgemeine Ergebnisse der Kupfterzell-lsolierung 68
3.2 Allgemeine Kulturbedingung 69
3.2.1 Kultivierung der HSC 69
3.2.2 Feststellung der tatsächlichen DNA-Reduplikation in den HSC 69
3.2.3 Untersuchung zur Feststellung der Zeitzahl in den HSC-Kulturen 70
3 3 Unirluß von konditioniertem Medium aus normalen llepatozyten auf primäre
und sekundäre HSC sowie die präparationsspe/.ifische Stimulation 71
3.3.1 Untersuchung an den primären HSC 71
3.3.2 Untersuchung an den sekundären HSC 72
3.3.3 Ausschluß einer Chargen-spezifischen
(Präparation-spezifischen) Eigenschaft 73
3.4 Charakterisierung der HSC-Proliferation unter dem
Einfluß des Hepatozyten-konditionierten Mediums 75
3.4.1 Untersuchung des Dose-Response-F.ffekts von PCcM auf
die HSC-Proliferation 75
3.4.2 Feststellung des optimalen Zeitpunktes zur Messung der
[3H]-Thymidin-Einbaurate in die DNA 77
3.4.3 Ermittlung der maximalen Proliferationsphase der HSC durch das
Hepatozyten-konditionierten Mediums- Untersuchung der
Zeitabhängigkeit 79
3.4.4 Morphologische Untersuchung der dem Hepatozyten-konditionierten
Medium exponierten HSC in der Phasen-Kontrastmikroskopie 81
3.4.5 Feststellung der Multiplikationstendenz der HSC je nach
Kulturdauer 83
3.4.6 Überprüfung des mitogenen Effekts des PCcM anhand der
Inkorporationsrate von Bromodesoxy-Uridin in die DNA 85
3.4.7 Untersuchung einer möglichen Proliferationsinhibition der HSC
durch das Ilepatozyten-konditionierte Medium 87
3.5 Untersuchung der HSC-Proliferation bei Veränderungen der
Konditionierungsbcdingungen der Hepatozytenmedien 89
3.5.1 Ermittlung des Dose-Response-Verhaltens im konditionierten
Medium hypoxisch geschädigter Hepatozyten auf die
der Proliferationsstimulation der HSC 89
3.5.2 Untersuchung der mitogenen Potenz der llepatozyten-kondilionierten
Medien auf die NSC-Proliferation nach unterschiedlichen
Behandlungsverfahren 91
3.5.3 Korrelation von LDH-Aktivität und mitogener
Potenz des PCcM auf die HSC-Proliferation 92
3.5.4 Untersuchung der mitogenen Aktivität im Hepatozytenlysat 95
3.6 PCcM-Einfluß auf PG-Synthese und -Muster in den HSC 97
3.6.1 Untersuchung des PCcM-Einflußes auf die Synllicserate von
Mediuinproteoglykanen bzw. auf ihr Muster 97
3.6.2 Untersuchung der Proteoglykansyntheserate der HSC während der
Exposition mit Hepatozyten- und Kupfferzcll-konditioniertcm Medium
sowie deren Kombination 99
3.7 Einfluß des Hepatozyten-konditionierten Mediums auf die Kollagen-
und Zytoskelettexpression bzw. -Muster 101
3.7.1 Qualitative Expression der Zytoskelettmarker 101
3.7.1.1 Einfluß des Hepatozyten-konditionierten Mediums auf die
Expression von Koltagen i yp 1 und HI,Fibroucctin und Latninin
in den HSC 101
3.7.1.2 Untersuchung der Expression von Desmin, a-Actin und
Vimentin durch die Behandlung der HSC mit Hepatozyten-
konditioniertem Medium 106
3.7.2 Quantitative Expression von Fibronectin und Kaminin in
Abhängigkeit von der Konditionierungsdauer und -niedien 110
3.8 Aktivitätscharaktcrisierung des/der mitogenen Faktors(en) 112
3.8.1 Einfluß des [lepatzyten-konditionierten Mediums an der Proliferation der
dermalen Rattenfibroblasten- eine Untersuchung auf Zellspezifität 112
3.8.2 Untersuchung auf Heparin-Bindungsaffinität des mitogenen Faktors
im Hepatozyten-konditionierten Medium 114
3.8.3 Isolierung und partielle Reinigung der mitogenen Aktivität 116
3.8.3.1 Isolierung mittels FPLC 116
3.8.3.2 Chemische und physikalische Charakterisierung der partiell
gereinigten mitogenen Aktiv iliit 118
3.9 Einfluß der konditionierten Medien von Hepatozyten und Kupffer-Zellen,
separat und in Kombination, auf die HSC-Protiferation 123
3.9.1 Dose-Response-Abhängigkeit bei der Proliferationsstimulation 123
3.9.^ Untersuchung der Zellmultipikation in Abhängigkeit von der Zeit,
konditioniert durch Hepatozyten- und Kupfferzetl-Medien und durch
deren Kombination 125
3.9.3 Untersuchung der HSC-Proliferation in Anwesenheit von Hepatozyten-
und Kupfferzell-Medien sowie deren Kombination 127
3.9.4 Einfluß der konditionierten Medien aus Hcpatozyten und Kupfferzellen,
separat und in Kombination, auf die IISC- Proliferation - visualisiert
durch die Bromodesoxy-Uridin-Inkorporarationsmelhode 129
3.9.5 Untersuchung der HSC-Proliferation unter sequentieller Zugabe von
Hepatozyten- und Kupfferzell-Medien 132
3.9.6 Morphologische Unterschiede der mit Hepatozyten- und / oder
Kupfferzell-konditionierten Medien behandelten HSC und der normalen
HSC in der Phasen-Kontrast-Mikroskopie 134
3.9.7 Untersuchung der Desmin- und a-Actin-Expression in den HSC-
Kulturen unter dem Einfluß von konditionierten Medien aus Hepatozyten
und/oder Kupfferzellen 135
3.10 Interaktion des Hepatozyten-konditionierten Mediums mit dem
mitoinhibitorischen Effekt von TGFßl bei der HSC-Proliferation in den
Primärkulturen 140
4. Diskussion.
4.1 Isolierung von Zellen und ihre Kultivierung 143
4.1.1 - Zellisolierung 143
4.1.2- Isolierung und Kultivierung von HSC 144
4.1.3- Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten 144
4.1.4-Isolierung und Kultivierung von Kupfferzellen 146
4.2 Methodik 146
4.2.1-Messung der Zeilproliferation 146
4.2.2- Synthese der Proteoglykane und Glykosaminoglykane 147
4.2.3-Nährmedium (FKS) 149
4.2.4- FPLC (fast protein liquid chromatography) 149
4.3 HSC unter dem Einfluß des hepatozyten-konditionienen Mediums 151
4.4 Charakterisierung des mitogenen Faktors 154
4.5 Rolle derZytokine in der Fibrogenese 159
4.5.1- Autokrine und parakrine Modulation der HSC-Proliferation 159
4.5.2- Die stimulierende Substanz aus Hepatozytenmedium -
ihre Rolle im Fibiogenese-Konzept 160
4.5.3- Konzept des Kaskademnechanismus der I ISC-Aktivierung 162
5. Zusammenfassung 164
6. Literatur 168
7. Lebenslauf 182
8. Meine akademischen Lehrer 184
9. Danksagung 185
10. Ehrenwörtliche Erklärung 186
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung.
1.1 Allgemeine Epidemiologie der Leberkrankheiten 1
1.2 Allgemeine Struktur des Leberparenchyms und zellulärer Aufbau 3
1.2.1 Hepatozyten, Parenchymzellen 4
1.2.2 nepalische Sternzellen (HSC, Ito-Zellen, perisinusoidale
Lipozyten, Vitamin A-Speicherzellen, hepatic stellate cells) 4
1.2.3 K.upfier-Zc!icn 9
1.2.4 Pil-Zellen (large granulär lymphocyles) 10
1.2.5 Endothelzellen 10
1.3 Die extrazelluläre Matrix der Leber 11
1.4 Wachstum-stimulierende Faktoren 14
1.5 Wachstum-inhibierende Faktoren 16
1.6 Leberfibrose 17
1.6.1 Die zellulären Komponenten der Leberfibrose 20
1.6.2 Die Rolle der Proteoglykane in der Leberfibrose 25
2. Material und Methoden.
2.1 Vii wendete Substanzen und ihre Fabrikate 29
2.2 Versuchstiere 32
2.3 Präparation und Isolierung der Zellen 32
2.3.1 Präparation und Isolierung der Parenchymzellen aus der Rattenleber 32
2.3.2 Präparation und Isolierung der HSC aus der Rattenleber 34
2.3.3 Präparation und Isolierung der Kupffer-Zellen aus der Rattenleber 36
2.3.4 Isolierung und Kultivierung von Hautfibroblasten der Ratte 37
2.4 Zellkulturen 39
2.4.1 Herstellung von Zellkulturmedien 39
2.4.2 Identifizierung und Reinheit der Kupffer-Zellen,HSC
und der Hepatozyten 39
2.4.3 Bestimmung der Zellzahl. Vitalität und Reinheit der Kulturen 41
2.4.4 Subkultivierung von Zellen in Monolayer Zellkultur 42
2.4.5 Präparation der Hepatozyten konditionierten Medien 43
2.4.6 Präparation des Hepatozyten-Lysats 43
2.5 Partielle Reinigung der mitogenen Aktivität des Hepatozyten-konditionierten
Mediums 44
2.5.1 FP1,C (fast protein liquid chromatography) 45
2.5.2 Gel-Permeationschromatographie 47
2.6 Charakterisierung der partiell gereinigten mitogenen Aktivität 49
2.6.1 Trypsinbehandlung 49
2.6.2 Überprüfung der Bindungsfahigkeit des mitogenen Faktors an HeparinSO
2.6.3 Hitzebeständigkeit des mitogenen Faktors 51
2.6.4 pH-Stabilität 51
2.6.5 Stabilität des mitogenen Faktors unter dem Einfluß
verschiedener chemischer bzw. organischer Substanzen 51
2.6.6 Behandlung mit reduzierenden Substanzen,
Proteinase-Inhibitor und Anti-TGF-a 52
2.7 Meßverfahren und Bestimmungsmcthoden 53
2.7.1 Fluometrische DNA-Bestimmune 53
2.7.2 Proteinbcstiininung nach Lowry 54
2.7.3 Proteinbestimmung für Membranproteine und
Proteine in außergewöhnlichen Puffern und Reagenzien 55
2.7.4 Bestimmung der [3H] hymidin-Inkorporation in die DNA der Zelle 56
2.7.5 Messung der Proteoglykan-Synlhescrale
in den Monolayer-Zellkulturen 57
2."/ Optische Darstellung der Zellproliferation mittels
Bromodesoxy-Uridin Inkorporation 60
2.7.7 Immunfluoreszenzfärbung der zytoskelctalen Proleine
und Proteine der extrazellulären Matrix [Fibroneetin (a),Laminin (b),
Tenascin (c), Desmin (d), Vimentin(e), sm-u-Actin (0] 62
2.7.8 Europium verstärkter zeitabhängiger Ftuoreszenzimmunoassay
von zellgebundenem l'ibronectin und Laminin 63
2.7.9 Arginase-Bestimmung 64
2.8 Ansäuerung des Kupfferzell-Mediums 66
2.9 Allgemeine Analyse-Verfahren 66
3. Ergebnisse.
3.1 Aussaatkriterien und Isolierung 67
3.!.! Allgemeine Bedingung 67
3.1.2 Allgemeine Ergebnisse der HSC-lsolierung 67
3.1.3 Allgemeine Ergebnisse der Hepatozyten-Präparation 68
3.1.4 Allgemeine Ergebnisse der Kupfterzell-lsolierung 68
3.2 Allgemeine Kulturbedingung 69
3.2.1 Kultivierung der HSC 69
3.2.2 Feststellung der tatsächlichen DNA-Reduplikation in den HSC 69
3.2.3 Untersuchung zur Feststellung der Zeitzahl in den HSC-Kulturen 70
3 3 Unirluß von konditioniertem Medium aus normalen llepatozyten auf primäre
und sekundäre HSC sowie die präparationsspe/.ifische Stimulation 71
3.3.1 Untersuchung an den primären HSC 71
3.3.2 Untersuchung an den sekundären HSC 72
3.3.3 Ausschluß einer Chargen-spezifischen
(Präparation-spezifischen) Eigenschaft 73
3.4 Charakterisierung der HSC-Proliferation unter dem
Einfluß des Hepatozyten-konditionierten Mediums 75
3.4.1 Untersuchung des Dose-Response-F.ffekts von PCcM auf
die HSC-Proliferation 75
3.4.2 Feststellung des optimalen Zeitpunktes zur Messung der
[3H]-Thymidin-Einbaurate in die DNA 77
3.4.3 Ermittlung der maximalen Proliferationsphase der HSC durch das
Hepatozyten-konditionierten Mediums- Untersuchung der
Zeitabhängigkeit 79
3.4.4 Morphologische Untersuchung der dem Hepatozyten-konditionierten
Medium exponierten HSC in der Phasen-Kontrastmikroskopie 81
3.4.5 Feststellung der Multiplikationstendenz der HSC je nach
Kulturdauer 83
3.4.6 Überprüfung des mitogenen Effekts des PCcM anhand der
Inkorporationsrate von Bromodesoxy-Uridin in die DNA 85
3.4.7 Untersuchung einer möglichen Proliferationsinhibition der HSC
durch das Ilepatozyten-konditionierte Medium 87
3.5 Untersuchung der HSC-Proliferation bei Veränderungen der
Konditionierungsbcdingungen der Hepatozytenmedien 89
3.5.1 Ermittlung des Dose-Response-Verhaltens im konditionierten
Medium hypoxisch geschädigter Hepatozyten auf die
der Proliferationsstimulation der HSC 89
3.5.2 Untersuchung der mitogenen Potenz der llepatozyten-kondilionierten
Medien auf die NSC-Proliferation nach unterschiedlichen
Behandlungsverfahren 91
3.5.3 Korrelation von LDH-Aktivität und mitogener
Potenz des PCcM auf die HSC-Proliferation 92
3.5.4 Untersuchung der mitogenen Aktivität im Hepatozytenlysat 95
3.6 PCcM-Einfluß auf PG-Synthese und -Muster in den HSC 97
3.6.1 Untersuchung des PCcM-Einflußes auf die Synllicserate von
Mediuinproteoglykanen bzw. auf ihr Muster 97
3.6.2 Untersuchung der Proteoglykansyntheserate der HSC während der
Exposition mit Hepatozyten- und Kupfferzcll-konditioniertcm Medium
sowie deren Kombination 99
3.7 Einfluß des Hepatozyten-konditionierten Mediums auf die Kollagen-
und Zytoskelettexpression bzw. -Muster 101
3.7.1 Qualitative Expression der Zytoskelettmarker 101
3.7.1.1 Einfluß des Hepatozyten-konditionierten Mediums auf die
Expression von Koltagen i yp 1 und HI,Fibroucctin und Latninin
in den HSC 101
3.7.1.2 Untersuchung der Expression von Desmin, a-Actin und
Vimentin durch die Behandlung der HSC mit Hepatozyten-
konditioniertem Medium 106
3.7.2 Quantitative Expression von Fibronectin und Kaminin in
Abhängigkeit von der Konditionierungsdauer und -niedien 110
3.8 Aktivitätscharaktcrisierung des/der mitogenen Faktors(en) 112
3.8.1 Einfluß des [lepatzyten-konditionierten Mediums an der Proliferation der
dermalen Rattenfibroblasten- eine Untersuchung auf Zellspezifität 112
3.8.2 Untersuchung auf Heparin-Bindungsaffinität des mitogenen Faktors
im Hepatozyten-konditionierten Medium 114
3.8.3 Isolierung und partielle Reinigung der mitogenen Aktivität 116
3.8.3.1 Isolierung mittels FPLC 116
3.8.3.2 Chemische und physikalische Charakterisierung der partiell
gereinigten mitogenen Aktiv iliit 118
3.9 Einfluß der konditionierten Medien von Hepatozyten und Kupffer-Zellen,
separat und in Kombination, auf die HSC-Protiferation 123
3.9.1 Dose-Response-Abhängigkeit bei der Proliferationsstimulation 123
3.9.^ Untersuchung der Zellmultipikation in Abhängigkeit von der Zeit,
konditioniert durch Hepatozyten- und Kupfferzetl-Medien und durch
deren Kombination 125
3.9.3 Untersuchung der HSC-Proliferation in Anwesenheit von Hepatozyten-
und Kupfferzell-Medien sowie deren Kombination 127
3.9.4 Einfluß der konditionierten Medien aus Hcpatozyten und Kupfferzellen,
separat und in Kombination, auf die IISC- Proliferation - visualisiert
durch die Bromodesoxy-Uridin-Inkorporarationsmelhode 129
3.9.5 Untersuchung der HSC-Proliferation unter sequentieller Zugabe von
Hepatozyten- und Kupfferzell-Medien 132
3.9.6 Morphologische Unterschiede der mit Hepatozyten- und / oder
Kupfferzell-konditionierten Medien behandelten HSC und der normalen
HSC in der Phasen-Kontrast-Mikroskopie 134
3.9.7 Untersuchung der Desmin- und a-Actin-Expression in den HSC-
Kulturen unter dem Einfluß von konditionierten Medien aus Hepatozyten
und/oder Kupfferzellen 135
3.10 Interaktion des Hepatozyten-konditionierten Mediums mit dem
mitoinhibitorischen Effekt von TGFßl bei der HSC-Proliferation in den
Primärkulturen 140
4. Diskussion.
4.1 Isolierung von Zellen und ihre Kultivierung 143
4.1.1 - Zellisolierung 143
4.1.2- Isolierung und Kultivierung von HSC 144
4.1.3- Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten 144
4.1.4-Isolierung und Kultivierung von Kupfferzellen 146
4.2 Methodik 146
4.2.1-Messung der Zeilproliferation 146
4.2.2- Synthese der Proteoglykane und Glykosaminoglykane 147
4.2.3-Nährmedium (FKS) 149
4.2.4- FPLC (fast protein liquid chromatography) 149
4.3 HSC unter dem Einfluß des hepatozyten-konditionienen Mediums 151
4.4 Charakterisierung des mitogenen Faktors 154
4.5 Rolle derZytokine in der Fibrogenese 159
4.5.1- Autokrine und parakrine Modulation der HSC-Proliferation 159
4.5.2- Die stimulierende Substanz aus Hepatozytenmedium -
ihre Rolle im Fibiogenese-Konzept 160
4.5.3- Konzept des Kaskademnechanismus der I ISC-Aktivierung 162
5. Zusammenfassung 164
6. Literatur 168
7. Lebenslauf 182
8. Meine akademischen Lehrer 184
9. Danksagung 185
10. Ehrenwörtliche Erklärung 186 |
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| spelling | Lotfi-Tabrizi, Sina Verfasser aut Parakrine Aktivierungsmechanismen der hepatischen Sternzellen durch Hepatozyten ein Beitag zur präinflammatorischen Phase der Leberfibrogenese von Sina Lotfi-Tabrizi 2005 183 S. Ill., graph. Darst. 21 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Marburg, Univ., Diss., 2005 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=014592422&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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