Effekte von proinflammatorischen Zytokinen auf den Glucosestoffwechsel isolierter Herzmuskelzellen adulter Ratten:
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| 1. Verfasser: | |
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| Sprache: | German |
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2005
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| Beschreibung: | Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005 |
| Beschreibung: | 109 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichni s
Inhaltsverzeichnis
I EINLEITUNG 1
1.1 Entzündliche Erkrankungen des Herzmuskels 1
1.2 Entzündung und der Glucosestoffwechsel 3
1.3 Ziele der Arbeit 5
II MATERIALIEN UND METHODEN 6
II. 1 Verwendete Materialien 6
II.1.1 Chemikalien 6
II. 1.2 Geräte 7
11.2 Versuchstiere 8
11.3 Isolierung von Herzmuskelzellen 8
11.4 Versuche bis 2 h Inkubationszeit 10
11.4.1 Weitere Behandlung der Zellen 10
11.4.2 Glucosetransport-Messung 11
11.4.3 Glucosetransportmessung an permeabilisierten Zellen 13
11.4.4 Glykolyse-Messung 14
11.4.5 Pyruvatoxidations-Messung 16
11.5 Langzeitversuche bis 20 h Inkubationszeit 17
11.5.1 Zellkulturbedingungen 17
11.5.2 Anheften der Zellen 19
11.5.3 Durchführung der Zellkultur 20
11.5.4 Glucosetransport-Messung 21
11.5.5 Pyruvatoxidations-Messung 22
11.6 Metabolit-Bestimmungen imZellkulturüberstand 23
11.6.1 Glucose-Bestimmung 23
11.6.2 Laktat-Bestimmung 23
11.6.3 Nitrit-Bestimmung 23
11.7 Kupffer-Zellen 24
11.8 Nachweis der Glucosetransporter GLUT 1 und GLUT4 24
Inhaltsverzeichnis ,
11.8.1 Behandlung der Zellen 24
11.8.2 Proteinbestimmung 25
11.8.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen 25
11.8.4 Western Blotting 26
11.8.5 Immundetektion der Proteine GLUT1,GLUT4 und iNOS 27
11.9 Immunzytochemischer Nachweis des Glucosetransporters
GLUT4 in der Konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie 28
11.10 Statistische Auswertung 29
IM ERGEBNISSE 30
III. 1 Akute metabolische Effekte von inflammatorischen Zytokinen auf
isolierte Herzmuskelzellen 30
111.1.1 Glucosetransport 30
III. 1.1.1 Akute Wirkungen von proinflammatorischen Zytokinen auf den
kardiomyozytären Glucosetransport 30
III.1.1.2 Akute Effekte des Ceramidase-lnhibitors NOE und des
Sphingosinkinase-Inhibitors DMS auf den kardiomyozytären
Glucosetransport 32
111.1.2 Glykolyse: Wirkung von TNF-a, IL-lß und S1P 35
111.1.3 Pyruvatoxidation: Wirkung von TNF-a, IL-lß und S1P 37
111.2 Akute Wirkung von Sphingosin-1 -Phosphat auf den
kardiomyozytären Glucosetransport 38
111.2.1 Dosis-Wirkungsbeziehung von S1P und dem AnalogonDH-SlP....38
111.2.2 Glucosetransport an permeabilisierten Zellen:
akute Wirkung von S1P 40
III.2.3. Akute Effekte von Lysophosphatidsäure und Sphingosyl-
Phosphorylcholin auf den Glucosetransport isolierter
Herzmuskelzellen 43
111.2.4 Einfluss von Sphingosin-1-Phosphat auf die subzelluläre
Verteilung des Glucosetransporters GLUT4 44
111.2.5 Additivität der Effekte von S1P und der Zytokine TNF-a und
IL-lß auf den Glucosetransport 47
111.3 Langfristige Effekte von proinflammatorischen Zytokinen auf den
kardiomyozytären Glucosestoffwechsel 49
111.3.1 Vergleich der Methoden für die Kurzzeit- und die
Langzeitinkubation hinsichtlich des Glucosetransports 50
111.3.2 Effekte von TNF-a, 1L-1 ß, IFN-y und LPS auf den
kardiomyozytären Glucosetransport 52
111.3.3 Abschätzung der Glykolyse-Rate über Glucose-Bestimmungen
im Zellkulturüberstand 55
Inhaltsverzeichnis
111.3.4 Laktat-Bildung von Kardiomyozyten 57
111.3.5 Immunzytochemischer Nachweis von GLUT1 und GLUT4 in
Herzmuskelzellen 58
111.3.6 Effekte von TNF-a, IL-lß, IFN-yund LPS auf die
Pyruvatoxidation isolierter Herzmuskelzellen 60
111.3.7 Die Frage nach dem vermittelnden Signal: Abhängigkeit
der Effekte der proinflammatorischen Zytokine von NO 61
111.3.7.1 Abhängigkeit der Metabolisierung von Glucose vom
NOS-Inhibitor L-NAME 62
111.3.7.2 Nitrit-Bildung von Kardiomyozyten und Kupfferzellen 64
111.3.7.3 Immunologischer Nachweis der iNOS-Expression in
Herzmuskelzellen und Kupffer-Zellen 65
IV DISKUSSION 67
IV. I Direkte Wirkungen von proinflammatorischen Zytokinen und
Sphingomyelin-Derivaten auf den Glucosestoffwechsel isolierter
Kardiomyozyten 67
IV.1.1 Akute Wirkungen von TNF-a und IL-lß auf den kardiomyozytären
Glucose transport 67
IV. 1.2 Der Sphingomyelinase-Signalweg und seine Bedeutung für den
kardiomyozytären Glucosetransport 68
IV. 1.3 Akute Wirkungen von proinflammatorischen Zytokinen auf die
kardiomyozytäre Glykolyse und Pyruvatoxidation 70
IV.2 Wirkung von S1P auf den Glucosetransport 73
IV.3 Bewertung des Zellkulturverfahrens für die längerfristige
Primärkultur von adulten Kardiomyozyten 77
IV.4 Lipopolysaccharid-Toleranz bei Herzmuskelzellen 80
IV.5 Langzeitwirkungen von proinflammatorischen Zytokinen auf die
kardiomyozytäre Glucoseutilisation 82
IV.5.1 Vergleich der Zytokinwirkuneen bei langer und bei kurzer
Inkubationszeit 82
IV.5.2 Hinweise für einen intrazellulären Energiemangel 83
IV.5.3 Vergleich der Expression der Glucosetransporter GLUT1 und
GLUT4 mit anderen Insulin-sensitiven Geweben 84
IV.5.4 Abhängigkeit der Effekte der proinflammatorischen Zytokine
von NO.7. 85
IV.6 Physiologische Bedeutung der Ergebnisse 86
V ZUSAMMENFASSUNG 88
Inhaltsverzeichnis
VI LITERATURVERZEICHNIS 90
VII ANHANG 105
Abkürzungsverzeichnis 105
Publikationsliste 107
Ein herzliches Dankeschön 108
Lebenslauf 109
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichni s
Inhaltsverzeichnis
I EINLEITUNG 1
1.1 Entzündliche Erkrankungen des Herzmuskels 1
1.2 Entzündung und der Glucosestoffwechsel 3
1.3 Ziele der Arbeit 5
II MATERIALIEN UND METHODEN 6
II. 1 Verwendete Materialien 6
II.1.1 Chemikalien 6
II. 1.2 Geräte 7
11.2 Versuchstiere 8
11.3 Isolierung von Herzmuskelzellen 8
11.4 Versuche bis 2 h Inkubationszeit 10
11.4.1 Weitere Behandlung der Zellen 10
11.4.2 Glucosetransport-Messung 11
11.4.3 Glucosetransportmessung an permeabilisierten Zellen 13
11.4.4 Glykolyse-Messung 14
11.4.5 Pyruvatoxidations-Messung 16
11.5 Langzeitversuche bis 20 h Inkubationszeit 17
11.5.1 Zellkulturbedingungen 17
11.5.2 Anheften der Zellen 19
11.5.3 Durchführung der Zellkultur 20
11.5.4 Glucosetransport-Messung 21
11.5.5 Pyruvatoxidations-Messung 22
11.6 Metabolit-Bestimmungen imZellkulturüberstand 23
11.6.1 Glucose-Bestimmung 23
11.6.2 Laktat-Bestimmung 23
11.6.3 Nitrit-Bestimmung 23
11.7 Kupffer-Zellen 24
11.8 Nachweis der Glucosetransporter GLUT 1 und GLUT4 24
Inhaltsverzeichnis ,
11.8.1 Behandlung der Zellen 24
11.8.2 Proteinbestimmung 25
11.8.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen 25
11.8.4 Western Blotting 26
11.8.5 Immundetektion der Proteine GLUT1,GLUT4 und iNOS 27
11.9 Immunzytochemischer Nachweis des Glucosetransporters
GLUT4 in der Konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie 28
11.10 Statistische Auswertung 29
IM ERGEBNISSE 30
III. 1 Akute metabolische Effekte von inflammatorischen Zytokinen auf
isolierte Herzmuskelzellen 30
111.1.1 Glucosetransport 30
III. 1.1.1 Akute Wirkungen von proinflammatorischen Zytokinen auf den
kardiomyozytären Glucosetransport 30
III.1.1.2 Akute Effekte des Ceramidase-lnhibitors NOE und des
Sphingosinkinase-Inhibitors DMS auf den kardiomyozytären
Glucosetransport 32
111.1.2 Glykolyse: Wirkung von TNF-a, IL-lß und S1P 35
111.1.3 Pyruvatoxidation: Wirkung von TNF-a, IL-lß und S1P 37
111.2 Akute Wirkung von Sphingosin-1 -Phosphat auf den
kardiomyozytären Glucosetransport 38
111.2.1 Dosis-Wirkungsbeziehung von S1P und dem AnalogonDH-SlP.38
111.2.2 Glucosetransport an permeabilisierten Zellen:
akute Wirkung von S1P 40
III.2.3. Akute Effekte von Lysophosphatidsäure und Sphingosyl-
Phosphorylcholin auf den Glucosetransport isolierter
Herzmuskelzellen 43
111.2.4 Einfluss von Sphingosin-1-Phosphat auf die subzelluläre
Verteilung des Glucosetransporters GLUT4 44
111.2.5 Additivität der Effekte von S1P und der Zytokine TNF-a und
IL-lß auf den Glucosetransport 47
111.3 Langfristige Effekte von proinflammatorischen Zytokinen auf den
kardiomyozytären Glucosestoffwechsel 49
111.3.1 Vergleich der Methoden für die Kurzzeit- und die
Langzeitinkubation hinsichtlich des Glucosetransports 50
111.3.2 Effekte von TNF-a, 1L-1 ß, IFN-y und LPS auf den
kardiomyozytären Glucosetransport 52
111.3.3 Abschätzung der Glykolyse-Rate über Glucose-Bestimmungen
im Zellkulturüberstand 55
Inhaltsverzeichnis
111.3.4 Laktat-Bildung von Kardiomyozyten 57
111.3.5 Immunzytochemischer Nachweis von GLUT1 und GLUT4 in
Herzmuskelzellen 58
111.3.6 Effekte von TNF-a, IL-lß, IFN-yund LPS auf die
Pyruvatoxidation isolierter Herzmuskelzellen 60
111.3.7 Die Frage nach dem vermittelnden Signal: Abhängigkeit
der Effekte der proinflammatorischen Zytokine von NO 61
111.3.7.1 Abhängigkeit der Metabolisierung von Glucose vom
NOS-Inhibitor L-NAME 62
111.3.7.2 Nitrit-Bildung von Kardiomyozyten und Kupfferzellen 64
111.3.7.3 Immunologischer Nachweis der iNOS-Expression in
Herzmuskelzellen und Kupffer-Zellen 65
IV DISKUSSION 67
IV. I Direkte Wirkungen von proinflammatorischen Zytokinen und
Sphingomyelin-Derivaten auf den Glucosestoffwechsel isolierter
Kardiomyozyten 67
IV.1.1 Akute Wirkungen von TNF-a und IL-lß auf den kardiomyozytären
Glucose transport 67
IV. 1.2 Der Sphingomyelinase-Signalweg und seine Bedeutung für den
kardiomyozytären Glucosetransport 68
IV. 1.3 Akute Wirkungen von proinflammatorischen Zytokinen auf die
kardiomyozytäre Glykolyse und Pyruvatoxidation 70
IV.2 Wirkung von S1P auf den Glucosetransport 73
IV.3 Bewertung des Zellkulturverfahrens für die längerfristige
Primärkultur von adulten Kardiomyozyten 77
IV.4 Lipopolysaccharid-Toleranz bei Herzmuskelzellen 80
IV.5 Langzeitwirkungen von proinflammatorischen Zytokinen auf die
kardiomyozytäre Glucoseutilisation 82
IV.5.1 Vergleich der Zytokinwirkuneen bei langer und bei kurzer
Inkubationszeit 82
IV.5.2 Hinweise für einen intrazellulären Energiemangel 83
IV.5.3 Vergleich der Expression der Glucosetransporter GLUT1 und
GLUT4 mit anderen Insulin-sensitiven Geweben 84
IV.5.4 Abhängigkeit der Effekte der proinflammatorischen Zytokine
von NO.7. 85
IV.6 Physiologische Bedeutung der Ergebnisse 86
V ZUSAMMENFASSUNG 88
Inhaltsverzeichnis
VI LITERATURVERZEICHNIS 90
VII ANHANG 105
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