Untersuchungen zur transkriptionellen Regulation der Glutaminsynthetase:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 2
1.1 Einführung 2
1.2 Feinanatomie und Physiologie der Leber 3
1.3 Glutaminsynthetase 4
1.4 Transkription und Transkriptionsfaktoren 6
1.5 Regulation der Glutaminsynthetase 7
1.6 Ziele der Arbeit 8
2 MATERIAL UND METHODEN 9
2.1 Material 9
2.1.1 Bezugsquellen 9
2.1.1.1 Chemikalien 9
2.1.1.2 Radiochemikalien 10
2.1.1.3 Enzyme 10
2.1.1.4 Kits 10
2.1.1.5 Verbrauchsmaterialien 10
2.1.1.6 Geräte 10
2.1.2 Medien, Agarplatten, Stammlösungen 11
2.1.2.1 Medien, Agarplatten 11
2.1.2.2 Stammlösungen 12
2.1.2.3 Proteaseinhibitorenstocklösungen: 12
2.1.3 Puffer 13
2.1.4 Versuchstiere 16
2.1.5 Zelllinie 16
2.1.6 Bakterienstämme 16
2.1.7 Plasmide 16
2.1.8 OligonukleotidefPrimer 16
2.2 Methoden 17
2.2.1 Kultivierung der Hep G2 Zellen: 17
2.2.2 Kryokonservierung von Hep G2 Zellen 17
2.2.3 Präparation rekombinanter DNA 17
2.2.3.1 Isolierung von Plasmid DNA aus 100 ml Kulturen (Maxi Prep) 17
2.2.3.2 Isolierung von Plasmid DNA aus 2ml Kulturen (Mini Prep) 18
2.2.3.3 Aufreinigung von DNA 18
2.2.3.3.1 DNA Reinigung und Gelextraktion mit der Glasmilchmethode 18
2.2.3.3.2 Phenol Chlorophorm/Isoamylalkohol Extraktion 18
2.2.3.3.3 Präparative DNA Elektrophorese 18
2.2.3.4 Konzentrationsbestimmung von DNA 19
2.2.3.4.1 Enzymatische Behandlung von DNA 19
2.2.3.5 Ligation 20
2.2.4 Transformation von rekombinanter DNA 20
2.2.4.1 Präparation kompetenter E. coli Zellen 20
2.2.4.2 Transformation von Bakterien 21
2.2.4.3 Kultivierung von Bakterien 21
2.2.5 Gelelektrophorese 21
2.2.5.1 Agarose Gel Elektrophorese 21
2.2.5.2 Nicht denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese für
Gelretardierungsexperimente 22
2.2.5.3 Denaturierende diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli....22
2.2.5.4 Kolloidale Coomassieblaufärbung 22
2.2.5.5 Silberfärbung von Proteingelen 22
2.2.5.6 Haltbarmachung von Acrylamidgelen 23
2.2.6 Präparation einer Rattenleber 23
2.2.7 Autoradiographie 23
2.2.8 Transiente Transfektion 23
2.2.8.1 Passage Hep G2 Zellen 23
2.2.8.2 Transfektion 24
2.2.8.3 Messung der Luciferase Aktivitäten in Zell Lysaten 24
2.2.8.4 Berechnung der relativen Expression 25
2.2.9 PCR: 25
2.2.10 Gelretardierungsexperimente 25
2.2.10.1 Isolation von Kernextrakten aus Hep G2 Zellen und Hepatozyten 25
2.2.10.2 Proteinbestimmung nach Bradford 26
2.2.10.3 Gelretardierungsassay (electrophoretic mobility shift assay.EMSA) 26
2.2.11 UV Crosslinking 27
2.2.11.1 Kontinuierliche radioaktive Markierung von DNA 27
2.2.11.2 Bindungsansatz 27
2.2.12 Proteinaufreinigung 28
2.2.12.1 Trichloressigsäurefällung 28
2.2.12.2 Ammoniumsulfatfällung 28
2.2.12.3 Dialyse 28
2.2.12.4 Schwimmdialyse (floating dialysis) 28
2.2.12.5 Konzentrierung und Entsalzung durch Filtration 29
2.2.12.6 Affinitätschromatographie mittels magnetischer Partikel 29
2.2.12.7 lonenaustauscherchromatographie 29
2.2.12.8 Sonden und Konkatemerkonstrukte 30
2.3 „Hindlll/EcoRV (Bereich 2520/ 2147) 30
2.4 „Hindlll/Taql (Bereich 2520/ 2370) 31
2.5 „Basti Oligo (Bereich 2462/ 2443) 31
2.6 „Enh 18 rev (Bereich 2503/ 2147) 31
2.7 „Enh 47 rev (Bereich 2474/ 2147) 31
2.8 „Enh 18 bast (Bereich 2503/ 2443) 31
2.9 „Enh 47 bast (Bereich 2474/ 2443) 32
2.10 Sim up/down biotiniliert (simB u/d) (Bereich 2503/ 2423) 32
2.11 „rep 21 (Konkatemer 2462/ 2443) 32
2.12 „UF7cc (Konkatemer 2503/ 2423) 33
3 ERGEBNISSE 35
3.1 Transfektionsexperimente mit der Enhancersequenz in pT81 35
3.2 Gelretardierungsassays mit dem Bereich ( 2520/ 2369) 36
3.3 Kompetitionsexperimente mit dem Bereich ( 2462/2443) und dem Konkatemer
( 2462/ 2444) „rep 21 37
3.4 Eingrenzung des Enhancer Bereichs 38
3.4.1 Kompetitionsexperimente mit „Enh 18 rev (Bereich 2503/ 2147) und „Enh 47 rev
(Bereich 2474/ 2147) 39
3.4.2 Kompetitionsexperimente mit dem Bereich ( 2503/ 2443) „Enh 18 bast und Bereich
( 2474/ 2443) „Enh 47 bast 39
3.4.3 Gelretardierungsexperimente mit „Enh 18 bast (Bereich 2503/ 2443) und „Enh 47 bast
(Bereich 2474/ 2443) 41
3.5 Sequenzrecherchen 42
3.6 UV Crosslinking Experimente 42
3.7 Etablierung von Reinigungsmethoden 43
3.7.1 Ammoniumsulfatfällung 44
3.7.2 lonenaustauschchromatographie 45
3.7.3 Affinitätschromatographie 48
4 DISKUSSION 51
4.1 Vorarbeiten und Methodenetablierung 51
4.2 Eingrenzung der Enhancer Region 53
4.3 Konkatemere 54
4.4 Molekulargewichtsbestimmung 55
4.5 Aufreinigung 57
4.5.1 Ammoniumsulfatfällung 58
4.5.2 lonenaustauschchromatographie 59
4.5.3 Affinität 60
4.6 Ausblick 62
5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 65
6 QUELLEN: 69
7 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT. 75
8 LEBENSLAUF 76
9 DANKSAGUNG 78
|
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Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 2
1.1 Einführung 2
1.2 Feinanatomie und Physiologie der Leber 3
1.3 Glutaminsynthetase 4
1.4 Transkription und Transkriptionsfaktoren 6
1.5 Regulation der Glutaminsynthetase 7
1.6 Ziele der Arbeit 8
2 MATERIAL UND METHODEN 9
2.1 Material 9
2.1.1 Bezugsquellen 9
2.1.1.1 Chemikalien 9
2.1.1.2 Radiochemikalien 10
2.1.1.3 Enzyme 10
2.1.1.4 Kits 10
2.1.1.5 Verbrauchsmaterialien 10
2.1.1.6 Geräte 10
2.1.2 Medien, Agarplatten, Stammlösungen 11
2.1.2.1 Medien, Agarplatten 11
2.1.2.2 Stammlösungen 12
2.1.2.3 Proteaseinhibitorenstocklösungen: 12
2.1.3 Puffer 13
2.1.4 Versuchstiere 16
2.1.5 Zelllinie 16
2.1.6 Bakterienstämme 16
2.1.7 Plasmide 16
2.1.8 OligonukleotidefPrimer" 16
2.2 Methoden 17
2.2.1 Kultivierung der Hep G2 Zellen: 17
2.2.2 Kryokonservierung von Hep G2 Zellen 17
2.2.3 Präparation rekombinanter DNA 17
2.2.3.1 Isolierung von Plasmid DNA aus 100 ml Kulturen (Maxi Prep) 17
2.2.3.2 Isolierung von Plasmid DNA aus 2ml Kulturen (Mini Prep) 18
2.2.3.3 Aufreinigung von DNA 18
2.2.3.3.1 DNA Reinigung und Gelextraktion mit der Glasmilchmethode 18
2.2.3.3.2 Phenol Chlorophorm/Isoamylalkohol Extraktion 18
2.2.3.3.3 Präparative DNA Elektrophorese 18
2.2.3.4 Konzentrationsbestimmung von DNA 19
2.2.3.4.1 Enzymatische Behandlung von DNA 19
2.2.3.5 Ligation 20
2.2.4 Transformation von rekombinanter DNA 20
2.2.4.1 Präparation kompetenter E. coli Zellen 20
2.2.4.2 Transformation von Bakterien 21
2.2.4.3 Kultivierung von Bakterien 21
2.2.5 Gelelektrophorese 21
2.2.5.1 Agarose Gel Elektrophorese 21
2.2.5.2 Nicht denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese für
Gelretardierungsexperimente 22
2.2.5.3 Denaturierende diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli.22
2.2.5.4 Kolloidale Coomassieblaufärbung 22
2.2.5.5 Silberfärbung von Proteingelen 22
2.2.5.6 Haltbarmachung von Acrylamidgelen 23
2.2.6 Präparation einer Rattenleber 23
2.2.7 Autoradiographie 23
2.2.8 Transiente Transfektion 23
2.2.8.1 Passage Hep G2 Zellen 23
2.2.8.2 Transfektion 24
2.2.8.3 Messung der Luciferase Aktivitäten in Zell Lysaten 24
2.2.8.4 Berechnung der relativen Expression 25
2.2.9 PCR: 25
2.2.10 Gelretardierungsexperimente 25
2.2.10.1 Isolation von Kernextrakten aus Hep G2 Zellen und Hepatozyten 25
2.2.10.2 Proteinbestimmung nach Bradford 26
2.2.10.3 Gelretardierungsassay (electrophoretic mobility shift assay.EMSA) 26
2.2.11 UV Crosslinking 27
2.2.11.1 Kontinuierliche radioaktive Markierung von DNA 27
2.2.11.2 Bindungsansatz 27
2.2.12 Proteinaufreinigung 28
2.2.12.1 Trichloressigsäurefällung 28
2.2.12.2 Ammoniumsulfatfällung 28
2.2.12.3 Dialyse 28
2.2.12.4 Schwimmdialyse (floating dialysis) 28
2.2.12.5 Konzentrierung und Entsalzung durch Filtration 29
2.2.12.6 Affinitätschromatographie mittels magnetischer Partikel 29
2.2.12.7 lonenaustauscherchromatographie 29
2.2.12.8 Sonden und Konkatemerkonstrukte 30
2.3 „Hindlll/EcoRV" (Bereich 2520/ 2147) 30
2.4 „Hindlll/Taql" (Bereich 2520/ 2370) 31
2.5 „Basti Oligo"(Bereich 2462/ 2443) 31
2.6 „Enh 18 rev" (Bereich 2503/ 2147) 31
2.7 „Enh 47 rev" (Bereich 2474/ 2147) 31
2.8 „Enh 18 bast" (Bereich 2503/ 2443) 31
2.9 „Enh 47 bast" (Bereich 2474/ 2443) 32
2.10 "Sim up/down biotiniliert (simB u/d)" (Bereich 2503/ 2423) 32
2.11 „rep 21" (Konkatemer 2462/ 2443) 32
2.12 „UF7cc" (Konkatemer 2503/ 2423) 33
3 ERGEBNISSE 35
3.1 Transfektionsexperimente mit der Enhancersequenz in pT81 35
3.2 Gelretardierungsassays mit dem Bereich ( 2520/ 2369) 36
3.3 Kompetitionsexperimente mit dem Bereich ( 2462/2443) und dem Konkatemer
( 2462/ 2444) „rep 21" 37
3.4 Eingrenzung des Enhancer Bereichs 38
3.4.1 Kompetitionsexperimente mit „Enh 18 rev" (Bereich 2503/ 2147) und „Enh 47 rev"
(Bereich 2474/ 2147) 39
3.4.2 Kompetitionsexperimente mit dem Bereich ( 2503/ 2443) „Enh 18 bast" und Bereich
( 2474/ 2443) „Enh 47 bast" 39
3.4.3 Gelretardierungsexperimente mit „Enh 18 bast" (Bereich 2503/ 2443) und „Enh 47 bast"
(Bereich 2474/ 2443) 41
3.5 Sequenzrecherchen 42
3.6 UV Crosslinking Experimente 42
3.7 Etablierung von Reinigungsmethoden 43
3.7.1 Ammoniumsulfatfällung 44
3.7.2 lonenaustauschchromatographie 45
3.7.3 Affinitätschromatographie 48
4 DISKUSSION 51
4.1 Vorarbeiten und Methodenetablierung 51
4.2 Eingrenzung der Enhancer Region 53
4.3 Konkatemere 54
4.4 Molekulargewichtsbestimmung 55
4.5 Aufreinigung 57
4.5.1 Ammoniumsulfatfällung 58
4.5.2 lonenaustauschchromatographie 59
4.5.3 Affinität 60
4.6 Ausblick 62
5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 65
6 QUELLEN: 69
7 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT. 75
8 LEBENSLAUF 76
9 DANKSAGUNG 78 |
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