In-vivo- und In-vitro-Untersuchungen zur Funktion des Peptids Diazepam-binding-Inhibitor als Cholecystokinin-freisetzendes Hormon:
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2004
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Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG 1
1.1 Einleitung 1
1.2 Fragestellung 4
2 METHODEN. S
2.1 Zellbiologische Methoden 5
2.1.1 Bakterienkultur 5
2.1.2 Zellkultui 5
2.1.3 Stimulationsversuche an STC 1 Zellen in Kultur 5
2.1.4 Bioassay zur Bestimmung der CCK Konzentration 6
2.2 Molekularbiologische Methoden 8
2.2.1 Herstellung transformationskompetenter Bakterien zur Elektroporatjon 8
2.2.2 Transformation von Bakterien 8
2.2.3 Isolation von Plasmid - DNA aus Bakterien 9
2.2.4 Restriktion von Plasmid - DNA 9
2.2.5 Gelelektrophorese von DNA 10
2.2.6 Aufreinigung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen 10
2.2.7 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 10
2.2.8 Gensonden für Northern Blot 11
2.2.9 Herstellung von radioaktiv markierten cDNA - Sonden 11
2.2.10 Isolation von Gesamt - RNA aus Gewebe oder Zellen 12
2.2.11 Isolation von RNA mit Silica Gel Membranen 12
2.2.12 Northern Blot Verfahren 13
2.2.13 Ermittlung der optimalen RNA Menge pro Blot/Prüfung der Sondenspezifität 15
2.2.14 Densitometrie und Standardisierung von Northern Blots 15
2.2.15 Polymerase chain reaction 16
2.2.16 Kompetitive PCR/ Mimic PCR 19
2.3 Tierexperimente 20
2.4 Patienten 22
2.5 Statistik 22
n
3 ERGEBNISSE 23
3.1 DBI-induzierte CCK Freisetzung durch STC-1 Zellen: Messung im Bioassay 23
3.2 Expression des c-Fos Gens in STC -1 Zellen 23
3.2.1 Northern Blots 23
3.2.2 Quantitative PCR 25
3.3 Untersuchung der DBI - Genexpression in Duodenalgewebe von Ratten 28
3.4 Expression von DBI und CCK bei Zöliakie - Patienten unter Gluten oder Diät 28
4 DISKUSSION 32
4.1 Methodenkritik 32
4.2 DBI als CCK-freisetzendes Hormon im Bioassay 34
4.3 DBI induziert das early response Gen c-fos 37
4.4 Die Genexpression von DBI im Duodenum 40
4.5 DBI und CCK Genexpression bei Patienten mit Zöliakie 42
5 ZUSAMMENFASSUNG 48
6 ANHANG I
6.1 Literaturverzeichnis i
6.2 Material ix
6.2.1 Chemikalien, Verbrauchsmaterial ix
6.2.2 Puffer und Lösungen x
6.2.3 Enzyme und Restriktionsendonukleasen xi
6.2.4 Reagenziensätze, Kits xii
6.2.5 Geräte xii
6.2.6 Tiergewebe, Zellen und Bakterienstämme xii
6.2.7 Tabellen: Patientendaten, Genexpression bei Zöliakie xiii
6.3 Danksagung xiv
ffl
6.4 Lebenslauf xv
6.5 Wissenschaftliche Veröffentlichungen xvi
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I
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG 1
1.1 Einleitung 1
1.2 Fragestellung 4
2 METHODEN. S
2.1 Zellbiologische Methoden 5
2.1.1 Bakterienkultur 5
2.1.2 Zellkultui 5
2.1.3 Stimulationsversuche an STC 1 Zellen in Kultur 5
2.1.4 Bioassay zur Bestimmung der CCK Konzentration 6
2.2 Molekularbiologische Methoden 8
2.2.1 Herstellung transformationskompetenter Bakterien zur Elektroporatjon 8
2.2.2 Transformation von Bakterien 8
2.2.3 Isolation von Plasmid - DNA aus Bakterien 9
2.2.4 Restriktion von Plasmid - DNA 9
2.2.5 Gelelektrophorese von DNA 10
2.2.6 Aufreinigung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen 10
2.2.7 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 10
2.2.8 Gensonden für Northern Blot 11
2.2.9 Herstellung von radioaktiv markierten cDNA - Sonden 11
2.2.10 Isolation von Gesamt - RNA aus Gewebe oder Zellen 12
2.2.11 Isolation von RNA mit Silica Gel Membranen 12
2.2.12 Northern Blot Verfahren 13
2.2.13 Ermittlung der optimalen RNA Menge pro Blot/Prüfung der Sondenspezifität 15
2.2.14 Densitometrie und Standardisierung von Northern Blots 15
2.2.15 Polymerase chain reaction 16
2.2.16 Kompetitive PCR/"Mimic" PCR 19
2.3 Tierexperimente 20
2.4 Patienten 22
2.5 Statistik 22
n
3 ERGEBNISSE 23
3.1 DBI-induzierte CCK Freisetzung durch STC-1 Zellen: Messung im Bioassay 23
3.2 Expression des c-Fos Gens in STC -1 Zellen 23
3.2.1 Northern Blots 23
3.2.2 Quantitative PCR 25
3.3 Untersuchung der DBI - Genexpression in Duodenalgewebe von Ratten 28
3.4 Expression von DBI und CCK bei Zöliakie - Patienten unter Gluten oder Diät 28
4 DISKUSSION 32
4.1 Methodenkritik 32
4.2 DBI als CCK-freisetzendes Hormon im Bioassay 34
4.3 DBI induziert das early response Gen c-fos 37
4.4 Die Genexpression von DBI im Duodenum 40
4.5 DBI und CCK Genexpression bei Patienten mit Zöliakie 42
5 ZUSAMMENFASSUNG 48
6 ANHANG I
6.1 Literaturverzeichnis i
6.2 Material ix
6.2.1 Chemikalien, Verbrauchsmaterial ix
6.2.2 Puffer und Lösungen x
6.2.3 Enzyme und Restriktionsendonukleasen xi
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6.2.6 Tiergewebe, Zellen und Bakterienstämme xii
6.2.7 Tabellen: Patientendaten, Genexpression bei Zöliakie xiii
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