Die prä-C-terminale Region der kleinen GTPase Rho: Rekrutierungsmotiv während der Epthelzellinfektion durch E. coli Flexneri
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2005
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INHALTSVERZEICHNIS 3
1 EINLEITUNG 6
1.1 Shigellen und die bakterielle Ruhr 6
1.1.1 Systematik und Epidemiologie 6
1.1.2 Klinische, pathogenetische und histopathologische Aspekte der Shigellose 6
1.2 Epithelinvasion und Virulenzfaktoren der Shigellen 7
1.2.1 Überquerung und Invasion des Darmepithels 7
1.2.2 Virulenzplasmid und Genprodukte 9
1.2.3 Zellinvasion - Reorganisation des epithelialen Aktinzytoskeletts 10
1.3 Kleine Rho-GTPasen - Regulatoren des Aktinzytoskeletts 11
1.3.1 Die kleinen GTPasen der Rho-Familie 11
1.3.2 Rho-GTPasen und das Aktinzytoskelett 12
1.3.3 Die Rho-Regulatorproteine der GEF- und GAP-Familie 13
1.3.4 Posttranslationale Modifikation von Rho und Regulation durch GDI 14
1.4 Rho-abhängige Signaltransduktionswege 14
1.4.1 Effektorproteine der kleinen GTPase Rho 14
1.4.2 Phospholipide und ERM-Proteine in der Signaltransduktion 16
1.4.3 Shigelleninvasionsprozess und die Regulierung durch Rho 18
1.5 Die drei Rho-Isoformen RhoA, RhoB und RhoC 19
1.5.1 Aminosäurensequenzen und biologische Unterschiede der Rho-Isoformen 19
1.5.2 Differenzielle Rekrutierung von RhoA, RhoB und RhoC am Shigelleninvasionsfokus 21
1.6 Herleitung der Fragestellung 21
2 MATERIAL UND METHODEN 23
2.1 Molekularbiologische Methoden 23
2.1.1 Plasmidgewinnung und -reinigung 23
2.1.1.1 Plasmid-Präparation - kleiner Maßstab ( Minipräp ) 23
2.1.1.2 Plasmid-Präparation - großer Maßstab ( Maxipräp ) 23
2.1.1.3 Phenol-Chloroform-Extraktion 24
2.1.1.4 Ethanolpräzipitation 25
2.1.1.5 Messen der DNA-Konzentration 25
2.1.2 Methoden zur Insert- und Vektorpräparation 25
2.1.2.1 Restriktion 25
2.1.2.2 Dephosphorylierung 26
2.1.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 27
2.1.2.4 Agarosegelelektrophorese 28
2.1.2.5 Präparative Gelelektrophorese und Gelextraktion 29
2.1.2.6 Hybridisierung und Phosphorylierung von Oligonukleotiden 29
2.1.3 Klonierung und Sequenzierung 30
2.1.3.1 Ligation 30
2.1.3.2 Herstellung kompetenter E. co i-Zellen 31
2.1.3.3 Transformation 31
2.1.3.4 Subkultivierung und Kontrolle der Klone 32
2.1.3.5 Sequenzierung 32
2.2 Zellbiologische Methoden 34
2.2.1 Kultivierung der Zellen 34
2.2.2 Transfektion 35
2.2.3 Infektion 35
2.2.4 Fixierung und Färbung der Zellen 36
2.3 Untersuchung der Präparate und Ergebnisdokumentation 37
2.3.1 Fluoreszenzmikroskopie und Bildaufnahme 37
2.3.2 Bildbearbeitung 38
2.4 Pufferzusammensetzungen 39
3 ERGEBNISSE 40
3.1 Herstellung der Rho-Konstrukte 40
3.1.1 DieKonstrukteRhoA-K186RundRhoA-K187R 40
3.1.2 DasKonstruktRhoC-RR186,187KK 43
3.1.2.1 Herstellung von RhoC-xmaci 44
3.1.2.2 Herstellung von RhoC-RR 186,187 KK 45
3.1.3 Sechs Konstrukte auf der Grundlage von RhoCAC 47
3.1.3.1 Herstellung von HA-RhoC-xmaci 48
3.1.3.2 Klonierung von HA-RhoC-xmaci in den Vektor pCl-neo3 49
3.1.3.3 Herstellung der sechs modifizierten HA-RhoCAC-Konstrukte 51
3.1.4 Zusammenfassung der hergestellten Konstrukte und transformierten Stämme 53
3.2 Untersuchung des Rekrutierungsverhaltens der transfizierten Konstrukte 53
3.2.1 Die Rekrutierungsmuster von RhoA und RhoC 54
3.2.2 Infektion transfizierter HeLa-Zellen mit E. coli Flexneri SC300 55
3.2.3 Rekrutierung der Konstrukte RhoA-K186R und RhoA-K187R 57
3.2.4 Rekrutierung des Konstruktes RhoC-RRl 86,187KK 58
3.2.5 Rekrutierung der sechs modifizierten RhoCAC-Konstrukte 59
3.2.6 Zusammenfassung der Rekrutierungsergebnisse 63
4 DISKUSSION 64
4.1 Diskussion der Methoden 64
4.1.1 Strategie der Konstruktherstellung 64
4.1.1.1 Erzeugung der XmaCl-Schnittstelle in RhoC 64
4.1.1.2 Klonierung hybridisierter Oligonukleotide 65
4.1.1.3 RhoCAC als Ausgangspunkt für sechs Konstrukte 65
4.1.2 Transiente Transfektion im eukaryoten Expressionsvektor pCI-neo3 66
4.1.3 Verwendung der Peptidepitope VSV-tag und HA-tag 66
4.2 Wertung der Ergebnisse 67
4.2.1 Theoretische Grundlagen der Untersuchungen 67
4.2.2 Wertung der Ergebnisse bezüglich der Vorarbeiten 68
4.3 Interpretation der Ergebnisse 70
4.3.1 Die prä-C-terminale Region in RhoA und RhoC - Grundlage für die isoformspezifische
Rekrutierung 70
4.3.2 Das potenzielle RhoA-Rekrutierungsmodul 72
4.3.3 Lipid-Rafts als membranorganisierende Strukturen 73
4.3.4 Bedeutung der prä-C-terminalen Region für Funktion und Lokalisation kleiner Rho-GTPasen 76
4.3.5 Das Rekrutierungsmotiv und die Regulationsmechanismen von Rho 78
4.3.6 Biotechnologischer Nutzen von Rekrutierungsmotiven und Bedeutung für die
Shigelleninfektion von Epithelzellen 81
5 ZUSAMMENFASSUNG 83
LITERATURVERZEICHNIS 85
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 94
TABELLENVERZEICHNIS 95
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 96
LEBENSLAUF 98
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 99
DANKSAGUNG 100
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1-1 Aminosäurensequenzen von RhoA, RhoB und RhoC im Vergleich 20
Abb. 3-1 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoA-K186R und RhoA-K187R 41
Abb. 3-2 Schematische Darstellung der PCR-Produkte Kpnl / RhoA-K 186R / PstI und
Kpnl / RhoA-K187R / PstI 42
Abb. 3-3 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pUC19 / VSV 42
Abb. 3-4 Schematische Darstellung des Konstruktes RhoC-RR186,187KK 43
Abb. 3-5 Schematische Darstellung des Konstruktes RhoC-xmaci 43
Abb. 3-6 Elektrophoretische Kontrolle nach Cfr9I/KpnI-Restriktion der Plasmid-DNA aus vier Klonen 45
Abb. 3-7 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pUC19 / VSV / RhoC-xmaci (aa 1-174) 46
Abb. 3-8 Schematische Darstellung des Hybridisierungsproduktes XmaCI /
RhoC-RR186,187KK(aal75-193)/PstI 46
Abb. 3-9 Schematische Darstellung der sechs auf RhoCAC beruhenden Konstrukte 47
Abb. 3-10 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors 48
Abb. 3-11 Schematische Darstellung des Hybridisierungsproduktes EcoRI / HA-tag / Kpnl 48
Abb. 3-12 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pUCI9 / HA / RhoC-xmaci 49
Abb. 3-13 Schematische Darstellung des Hybridisierungsproduktes PstI / Linker2 / Hindlll 50
Abb. 3-14 Elektrophoretische Kontrolle nach Restriktion der Plasmid-DNA des asservierten Klons 50
Abb. 3-15 Schema des in den Vektor pCI-neo3 einzufügenden Inserts HA - RhoC-xmaci - Linker2 50
Abb. 3-16 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pCI-neo3 51
Abb. 3-17 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pCI-neo3 / HA / RhoC-xmaci (aa 1-174) 51
Abb. 3-18 Modell für den schematischen Autbau der Hybridisierungsprodukte der Oligonukleotide
100 bis 111 aus kodierendem (es) und nicht kodierendem (ncs) Strang 52
Abb. 3-19 Rekrutierungsmuster von RhoC-xmaci (a-d) und RhoA (e und f) 55
Abb. 3-20 Verteilung von RhoA (a-d), RhoC-xmaci (e-m) und RhoC-RR186,187KK (n-q) in HeLa-Zellen
nach Infektion mit dem nicht-invasiven Stamm SC300 56
Abb. 3-21 Rekrutierungsverhalten von RhoA-KK 186,187RR 57
Abb. 3-22 Rekrutierungsverhalten von RhoA-K187R (a-c) und RhoA-K186R (d-m) 58
Abb. 3-23 Rekrutierungsverhalten von RhoC-RR186,187KK 59
Abb. 3-24 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC 60
Abb. 3-25 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC-C183,184 (a-d) und RhoCAC-C184,188 (e-h) 61
Abb. 3-26 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC-C181,183 (a und b) und RhoCAC-C183,188 (c und d)
während Shigelleninvasion stabil mit RhoA transfizierter HeLa-Zellen 62
Abb. 4-1 Die prä-C-terminalen Bereiche (Aminosäuren 181 bis 188) von RhoA und RhoC im Vergleich 71
Abb. 4-2 Schematische Darstellung der Membranbindung von Rho 71
Tabellenverzeichnis
Tab. 1-1 Aufbau und Rekrutierungsergebnisse bereits untersuchter RhoA- und RhoC-Mutanten 22
Tab. 2-1 Übersicht der verwendeten Restriktionsenzyme und Puffer 26
Tab. 2-2 Übersicht der bei PCRs verwendeten Oligonukleotidprimer 27
Tab. 2-3 PCR-Ansätze mit Taq- und Pwo-DNA-Polymerase 28
Tab. 2-4 Übersicht der zur Hybridisierung verwendeten Oligonukleotide 30
Tab. 2-5 Zur Sequenzierung verwendete Oligonukleotide 33
Tab. 2-6 Übersicht der verwendeten Antikörper 37
Tab. 2-7 Übersicht der Filtersätze für die Immunfluoreszenzmikroskopie 37
Tab. 3-1 Übersicht der Oligonukleotide 007, 085 und 084 41
Tab. 3-2 PCR-Profil der PCR mit Pwo-DNA-Polymerase 42
Tab. 3-3 Übersicht der Oligonukleotide 025 und 094 44
Tab. 3-4 PCR-Profil der PCR mit Taq-DNA-Polymerase 45
Tab. 3-5 Übersicht der Oligonukleotide 095 und 096 46
Tab. 3-6 Übersicht der Oligonukleotide 098 und 099 48
Tab. 3-7 Übersicht der Oligonukleotide 086 und 087 49
Tab. 3-8 Übersicht der Oligonukleotide 100 bis 111 52
Tab. 3-9 Übersicht der hergestellten Konstrukte 53
Tab. 3-10 Übersicht der transformierten Stämme 53
Tab. 3-11 Übersicht des Rekrutierungsverhaltens der hergestellten Konstrukte 63
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Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS 3
1 EINLEITUNG 6
1.1 Shigellen und die bakterielle Ruhr 6
1.1.1 Systematik und Epidemiologie 6
1.1.2 Klinische, pathogenetische und histopathologische Aspekte der Shigellose 6
1.2 Epithelinvasion und Virulenzfaktoren der Shigellen 7
1.2.1 Überquerung und Invasion des Darmepithels 7
1.2.2 Virulenzplasmid und Genprodukte 9
1.2.3 Zellinvasion - Reorganisation des epithelialen Aktinzytoskeletts 10
1.3 Kleine Rho-GTPasen - Regulatoren des Aktinzytoskeletts 11
1.3.1 Die kleinen GTPasen der Rho-Familie 11
1.3.2 Rho-GTPasen und das Aktinzytoskelett 12
1.3.3 Die Rho-Regulatorproteine der GEF- und GAP-Familie 13
1.3.4 Posttranslationale Modifikation von Rho und Regulation durch GDI 14
1.4 Rho-abhängige Signaltransduktionswege 14
1.4.1 Effektorproteine der kleinen GTPase Rho 14
1.4.2 Phospholipide und ERM-Proteine in der Signaltransduktion 16
1.4.3 Shigelleninvasionsprozess und die Regulierung durch Rho 18
1.5 Die drei Rho-Isoformen RhoA, RhoB und RhoC 19
1.5.1 Aminosäurensequenzen und biologische Unterschiede der Rho-Isoformen 19
1.5.2 Differenzielle Rekrutierung von RhoA, RhoB und RhoC am Shigelleninvasionsfokus 21
1.6 Herleitung der Fragestellung 21
2 MATERIAL UND METHODEN 23
2.1 Molekularbiologische Methoden 23
2.1.1 Plasmidgewinnung und -reinigung 23
2.1.1.1 Plasmid-Präparation - kleiner Maßstab ('Minipräp') 23
2.1.1.2 Plasmid-Präparation - großer Maßstab ('Maxipräp') 23
2.1.1.3 Phenol-Chloroform-Extraktion 24
2.1.1.4 Ethanolpräzipitation 25
2.1.1.5 Messen der DNA-Konzentration 25
2.1.2 Methoden zur Insert- und Vektorpräparation 25
2.1.2.1 Restriktion 25
2.1.2.2 Dephosphorylierung 26
2.1.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 27
2.1.2.4 Agarosegelelektrophorese 28
2.1.2.5 Präparative Gelelektrophorese und Gelextraktion 29
2.1.2.6 Hybridisierung und Phosphorylierung von Oligonukleotiden 29
2.1.3 Klonierung und Sequenzierung 30
2.1.3.1 Ligation 30
2.1.3.2 Herstellung kompetenter E. co\i-Zellen 31
2.1.3.3 Transformation 31
2.1.3.4 Subkultivierung und Kontrolle der Klone 32
2.1.3.5 Sequenzierung 32
2.2 Zellbiologische Methoden 34
2.2.1 Kultivierung der Zellen 34
2.2.2 Transfektion 35
2.2.3 Infektion 35
2.2.4 Fixierung und Färbung der Zellen 36
2.3 Untersuchung der Präparate und Ergebnisdokumentation 37
2.3.1 Fluoreszenzmikroskopie und Bildaufnahme 37
2.3.2 Bildbearbeitung 38
2.4 Pufferzusammensetzungen 39
3 ERGEBNISSE 40
3.1 Herstellung der Rho-Konstrukte 40
3.1.1 DieKonstrukteRhoA-K186RundRhoA-K187R 40
3.1.2 DasKonstruktRhoC-RR186,187KK 43
3.1.2.1 Herstellung von RhoC-xmaci 44
3.1.2.2 Herstellung von RhoC-RR 186,187'KK 45
3.1.3 Sechs Konstrukte auf der Grundlage von RhoCAC 47
3.1.3.1 Herstellung von HA-RhoC-xmaci 48
3.1.3.2 Klonierung von HA-RhoC-xmaci in den Vektor pCl-neo3 49
3.1.3.3 Herstellung der sechs modifizierten HA-RhoCAC-Konstrukte 51
3.1.4 Zusammenfassung der hergestellten Konstrukte und transformierten Stämme 53
3.2 Untersuchung des Rekrutierungsverhaltens der transfizierten Konstrukte 53
3.2.1 Die Rekrutierungsmuster von RhoA und RhoC 54
3.2.2 Infektion transfizierter HeLa-Zellen mit E. coli Flexneri SC300 55
3.2.3 Rekrutierung der Konstrukte RhoA-K186R und RhoA-K187R 57
3.2.4 Rekrutierung des Konstruktes RhoC-RRl 86,187KK 58
3.2.5 Rekrutierung der sechs modifizierten RhoCAC-Konstrukte 59
3.2.6 Zusammenfassung der Rekrutierungsergebnisse 63
4 DISKUSSION 64
4.1 Diskussion der Methoden 64
4.1.1 Strategie der Konstruktherstellung 64
4.1.1.1 Erzeugung der XmaCl-Schnittstelle in RhoC 64
4.1.1.2 Klonierung hybridisierter Oligonukleotide 65
4.1.1.3 RhoCAC als Ausgangspunkt für sechs Konstrukte 65
4.1.2 Transiente Transfektion im eukaryoten Expressionsvektor pCI-neo3 66
4.1.3 Verwendung der Peptidepitope VSV-tag und HA-tag 66
4.2 Wertung der Ergebnisse 67
4.2.1 Theoretische Grundlagen der Untersuchungen 67
4.2.2 Wertung der Ergebnisse bezüglich der Vorarbeiten 68
4.3 Interpretation der Ergebnisse 70
4.3.1 Die prä-C-terminale Region in RhoA und RhoC - Grundlage für die isoformspezifische
Rekrutierung 70
4.3.2 Das potenzielle RhoA-Rekrutierungsmodul 72
4.3.3 Lipid-Rafts als membranorganisierende Strukturen 73
4.3.4 Bedeutung der prä-C-terminalen Region für Funktion und Lokalisation kleiner Rho-GTPasen 76
4.3.5 Das Rekrutierungsmotiv und die Regulationsmechanismen von Rho 78
4.3.6 Biotechnologischer Nutzen von Rekrutierungsmotiven und Bedeutung für die
Shigelleninfektion von Epithelzellen 81
5 ZUSAMMENFASSUNG 83
LITERATURVERZEICHNIS 85
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 94
TABELLENVERZEICHNIS 95
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 96
LEBENSLAUF 98
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 99
DANKSAGUNG 100
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1-1 Aminosäurensequenzen von RhoA, RhoB und RhoC im Vergleich 20
Abb. 3-1 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoA-K186R und RhoA-K187R 41
Abb. 3-2 Schematische Darstellung der PCR-Produkte Kpnl / RhoA-K 186R / PstI und
Kpnl / RhoA-K187R / PstI 42
Abb. 3-3 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pUC19 / VSV 42
Abb. 3-4 Schematische Darstellung des Konstruktes RhoC-RR186,187KK 43
Abb. 3-5 Schematische Darstellung des Konstruktes RhoC-xmaci 43
Abb. 3-6 Elektrophoretische Kontrolle nach Cfr9I/KpnI-Restriktion der Plasmid-DNA aus vier Klonen 45
Abb. 3-7 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pUC19 / VSV / RhoC-xmaci (aa 1-174) 46
Abb. 3-8 Schematische Darstellung des Hybridisierungsproduktes XmaCI /
RhoC-RR186,187KK(aal75-193)/PstI 46
Abb. 3-9 Schematische Darstellung der sechs auf RhoCAC beruhenden Konstrukte 47
Abb. 3-10 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors 48
Abb. 3-11 Schematische Darstellung des Hybridisierungsproduktes EcoRI / HA-tag / Kpnl 48
Abb. 3-12 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pUCI9 / HA / RhoC-xmaci 49
Abb. 3-13 Schematische Darstellung des Hybridisierungsproduktes PstI / Linker2 / Hindlll 50
Abb. 3-14 Elektrophoretische Kontrolle nach Restriktion der Plasmid-DNA des asservierten Klons 50
Abb. 3-15 Schema des in den Vektor pCI-neo3 einzufügenden Inserts HA - RhoC-xmaci - Linker2 50
Abb. 3-16 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pCI-neo3 51
Abb. 3-17 Schematische Darstellung des Klonierungsvektors pCI-neo3 / HA / RhoC-xmaci (aa 1-174) 51
Abb. 3-18 Modell für den schematischen Autbau der Hybridisierungsprodukte der Oligonukleotide
100 bis 111 aus kodierendem (es) und nicht kodierendem (ncs) Strang 52
Abb. 3-19 Rekrutierungsmuster von RhoC-xmaci (a-d) und RhoA (e und f) 55
Abb. 3-20 Verteilung von RhoA (a-d), RhoC-xmaci (e-m) und RhoC-RR186,187KK (n-q) in HeLa-Zellen
nach Infektion mit dem nicht-invasiven Stamm SC300 56
Abb. 3-21 Rekrutierungsverhalten von RhoA-KK 186,187RR 57
Abb. 3-22 Rekrutierungsverhalten von RhoA-K187R (a-c) und RhoA-K186R (d-m) 58
Abb. 3-23 Rekrutierungsverhalten von RhoC-RR186,187KK 59
Abb. 3-24 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC 60
Abb. 3-25 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC-C183,184 (a-d) und RhoCAC-C184,188 (e-h) 61
Abb. 3-26 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC-C181,183 (a und b) und RhoCAC-C183,188 (c und d)
während Shigelleninvasion stabil mit RhoA transfizierter HeLa-Zellen 62
Abb. 4-1 Die prä-C-terminalen Bereiche (Aminosäuren 181 bis 188) von RhoA und RhoC im Vergleich 71
Abb. 4-2 Schematische Darstellung der Membranbindung von Rho 71
Tabellenverzeichnis
Tab. 1-1 Aufbau und Rekrutierungsergebnisse bereits untersuchter RhoA- und RhoC-Mutanten 22
Tab. 2-1 Übersicht der verwendeten Restriktionsenzyme und Puffer 26
Tab. 2-2 Übersicht der bei PCRs verwendeten Oligonukleotidprimer 27
Tab. 2-3 PCR-Ansätze mit Taq- und Pwo-DNA-Polymerase 28
Tab. 2-4 Übersicht der zur Hybridisierung verwendeten Oligonukleotide 30
Tab. 2-5 Zur Sequenzierung verwendete Oligonukleotide 33
Tab. 2-6 Übersicht der verwendeten Antikörper 37
Tab. 2-7 Übersicht der Filtersätze für die Immunfluoreszenzmikroskopie 37
Tab. 3-1 Übersicht der Oligonukleotide 007, 085 und 084 41
Tab. 3-2 PCR-Profil der PCR mit Pwo-DNA-Polymerase 42
Tab. 3-3 Übersicht der Oligonukleotide 025 und 094 44
Tab. 3-4 PCR-Profil der PCR mit Taq-DNA-Polymerase 45
Tab. 3-5 Übersicht der Oligonukleotide 095 und 096 46
Tab. 3-6 Übersicht der Oligonukleotide 098 und 099 48
Tab. 3-7 Übersicht der Oligonukleotide 086 und 087 49
Tab. 3-8 Übersicht der Oligonukleotide 100 bis 111 52
Tab. 3-9 Übersicht der hergestellten Konstrukte 53
Tab. 3-10 Übersicht der transformierten Stämme 53
Tab. 3-11 Übersicht des Rekrutierungsverhaltens der hergestellten Konstrukte 63 |
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