Die Rolle Cardiotrophin-1-induzierter reaktiver Sauerstoffintermediate bei der kardialen Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus:
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2005
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| Beschreibung: | Köln, Univ., Diss., 2005 |
| Beschreibung: | 88 S. Ill., graph. Darst. |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Embryonale Stammzellen ( ES-Zellen ) und Enibryoid Bodies ( EB s)
als in W/ro-Modellsystem der embryonalen Differenzierung 1
1.1.1 Herkunft, Gewinnung und Kultivierung 1
1.1.2 Möglichkeiten und Grenzen der Stammzellforschung 2
1.1.3 Ausblick 3
1.2 Kardiale Differenzierung und Kardiogenese 4
1.2.1 Allgemeines 4
1.2.2 Gesamtverlauf der Kardiogenese-ein kurzer Überblick 4
1.3 Cardiotrophin-1 (CT-1 ) 5
1.3.1 Was ist CT-1 ? 5
1.3.2 Effekte von CT-1 6
1.3.3 Durch Wachstumsfaktoren und Zytokine beeinflusste intrazelluläre
Signalkaskaden 7
1.3.3.1 Vorbemerkung 7
1.3.3.2 Glykoprotein 130(gpl30) 7
1.3 3.3 Jaiiusküiase ( JAK ) und Signaltransduktor und Aktivator der Transkription ( STAT ) 8
1.3.3.4 Mitogen aktivierte Proteinkinase ( MAPK ) 9
1.3.3.5 Nuclear factor kappa B ( NFkB )/Kernfaktor kappa B 10
1.3.3.6 PhosphatidylinositoB-Kinase ( PI3-K ) 11
1.4 Reaktive Sauerstoffintermediate (ROI) und ihre Bedeutung für einzelne
Zellfunktionen 12
1.4.1 ROI und freie Radikale - eine Begriffserläuterung 12
1.4.2 Die Rolle von ROI bei der intrazellulären Signalübermittlung 13
1.4.3 Nachweis von ROI 3
1.5 Fragestellung 14
2. Material und Methoden 15
2.1 Material ls
2.1.1 Abkürzungen ls
2.1.2 Herstellerfirmen der Chemikalien und Geräte 17
2.1.3 Verwendete Geräte und Materialien 18
2.1.4 Verwendete Substanzen 18
2.1.5 Zusammensetzung der Lösungen, Puffer und Zellkulturmedien 20
2.1.5.1 Fixationslösungen 20
2.1.5.2 Kollagenaselösung 20
2.1.5.3 Puffer 20
2.1.5.4 Zellkulfumiedien 21
2.2 Methoden 23
2.2.1 Die konfokale Laser-Raster / Laser-Scan-Mikroskopie ( CLSM ) 23
2.2.2 Kultivierung der ES-Zellen 24
2.2.2.1 permanente Zellkultur 25
2.2.2.2 Passage der Stammzellen 26
2.2.3 Kultivierung, Ausplattierung und Dissoziation von EB s 26
2.2.3.1 Kultivierung in Spinnerflaschen 26
2.2.3.2 Ausplattierang und Dissoziation von EB s 27
2.2.4 Versuchssinsätze an EB s und dissozierten Einzelzellen 28
2.2.4.1 CT-1 und Hemmstoffe 28
2.2 4.2 Versuchsansätze an Einzelzellen als Grundlage für Antikörpermarkierungen 29
2.2.4.3 Antikörperfarbungen und deren Auswertung atn LSM 29
2.2.4.4 Beschreibung der verwendeten primären und sekundären Antikörper 31
2.2.4.5 DCF-Messungen an dissoziierten Einzelzellen 33
2 2.4.6 Bestimmung des intrazellularen Ca^-Gehaltes dissozierter Einzelzellen 33
2.2.5 Statistik 34
3. Ergebnisse 35
3.1 Vorbemerkungen 35
3.1.1 Einsatz von Radikalfängern und Hemmstoffen 35
3.1.2 Abschließende Betrachtung zur experimentellen Vorgehensweise 35
3.2 Ergebnisbesprechung 36
3.2.1 EB s expi inneren CT-1 endogen in Abhängigkeit von ihrem Entwicklungs-
stadium 36
3.2.2 CT-1 steigert redoxreguliert die Proliferationsrate ES-Zell-abgeleiteter Herzmuskelzellen 38
3.2.3 CT-1 induziert die Bildung von ROI in ES-Zell-abgeleiteten Herzmuskelzellen 40
3.2.4 Durch CT-1 aktivierte Signalwege 43
3.2.4.1 Vorbemerkung 43
3.2.4.2 CT-1 aktiviert den JAK2-Signalweg 43
3.2.4.3 CT-1 aktiviert den STAT3-Signalweg 47
3.2.4.4 CT-1 aktiviert den ERK 1 / 2-Signalweg 52
3.2.4.5 CT-1 aktiviert den NFKB-Signalweg 55
3.2 5 CT-1 ist ohne EinfluB auf intrazelluläre Ca: Iransienlen in ES-Zell-abgeleiteten
Herzmuskelzellen 58
4. Diskussion 59
4.1 Vorbemerkung 59
4.2 Die durch CT-1 induzierte Proliferationssteigerung ES-Zell-abgeleiteter
Kardiomyozyten ist redoxreguliert 59
4.3 CT-1 und die Abhängigkeit seiner endogenen Expression vom
Entwicklungsstadium der EB s 60
4.4 CT-1-induzierte Generierung von ROI 60
4.5 Durch CT-1 induzierte Signalwege sind redoxreguliert 62
4.5.1 Allgemeines 62
4.5.2 Der JAK-STAT-Signalweg 62
453 Der MAPK-Signalweg 64
4.5.4 Der INFicB-Signalweg 65
4.5.5 CT-1-induzierte Signalwegsaktivierung und ROI 66
4.6 Ca: -Signale sind an CT-1-induzierter Signaltransduktion nicht
beteiligt 66
4.7 Zusammenfassung und Ausblick 68
4.7.1 Zusammenfassung u d 68
4.7.2 Ausblick 70
5. Literaturverzeichnis 71
6. Vorabveröffentlichungen 87
7. Lebenslauf 88
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Embryonale Stammzellen ( ES-Zellen ) und Enibryoid Bodies ( EB's)
als in W/ro-Modellsystem der embryonalen Differenzierung 1
1.1.1 Herkunft, Gewinnung und Kultivierung 1
1.1.2 Möglichkeiten und Grenzen der Stammzellforschung 2
1.1.3 Ausblick 3
1.2 Kardiale Differenzierung und Kardiogenese 4
1.2.1 Allgemeines 4
1.2.2 Gesamtverlauf der Kardiogenese-ein kurzer Überblick 4
1.3 Cardiotrophin-1 (CT-1 ) 5
1.3.1 Was ist CT-1 ? 5
1.3.2 Effekte von CT-1 6
1.3.3 Durch Wachstumsfaktoren und Zytokine beeinflusste intrazelluläre
Signalkaskaden 7
1.3.3.1 Vorbemerkung 7
1.3.3.2 Glykoprotein 130(gpl30) 7
1.3 3.3 Jaiiusküiase ( JAK ) und Signaltransduktor und Aktivator der Transkription ( STAT ) 8
1.3.3.4 Mitogen aktivierte Proteinkinase ( MAPK ) 9
1.3.3.5 Nuclear factor kappa B ( NFkB )/Kernfaktor kappa B 10
1.3.3.6 PhosphatidylinositoB-Kinase ( PI3-K ) 11
1.4 Reaktive Sauerstoffintermediate (ROI) und ihre Bedeutung für einzelne
Zellfunktionen 12
1.4.1 ROI und freie Radikale - eine Begriffserläuterung 12
1.4.2 Die Rolle von ROI bei der intrazellulären Signalübermittlung 13
1.4.3 Nachweis von ROI '3
1.5 Fragestellung 14
2. Material und Methoden 15
2.1 Material ls
2.1.1 Abkürzungen ls
2.1.2 Herstellerfirmen der Chemikalien und Geräte 17
2.1.3 Verwendete Geräte und Materialien 18
2.1.4 Verwendete Substanzen 18
2.1.5 Zusammensetzung der Lösungen, Puffer und Zellkulturmedien 20
2.1.5.1 Fixationslösungen 20
2.1.5.2 Kollagenaselösung 20
2.1.5.3 Puffer 20
2.1.5.4 Zellkulfumiedien 21
2.2 Methoden 23
2.2.1 Die konfokale Laser-Raster / Laser-Scan-Mikroskopie ( CLSM ) 23
2.2.2 Kultivierung der ES-Zellen 24
2.2.2.1 permanente Zellkultur 25
2.2.2.2 Passage der Stammzellen 26
2.2.3 Kultivierung, Ausplattierung und Dissoziation von EB's 26
2.2.3.1 Kultivierung in Spinnerflaschen 26
2.2.3.2 Ausplattierang und Dissoziation von EB's 27
2.2.4 Versuchssinsätze an EB's und dissozierten Einzelzellen 28
2.2.4.1 CT-1 und Hemmstoffe 28
2.2 4.2 Versuchsansätze an Einzelzellen als Grundlage für Antikörpermarkierungen 29
2.2.4.3 Antikörperfarbungen und deren Auswertung atn LSM 29
2.2.4.4 Beschreibung der verwendeten primären und sekundären Antikörper 31
2.2.4.5 DCF-Messungen an dissoziierten Einzelzellen 33
2 2.4.6 Bestimmung des intrazellularen Ca^-Gehaltes dissozierter Einzelzellen 33
2.2.5 Statistik 34
3. Ergebnisse 35
3.1 Vorbemerkungen 35
3.1.1 Einsatz von Radikalfängern und Hemmstoffen 35
3.1.2 Abschließende Betrachtung zur experimentellen Vorgehensweise 35
3.2 Ergebnisbesprechung 36
3.2.1 EB's expi inneren CT-1 endogen in Abhängigkeit von ihrem Entwicklungs-
stadium 36
3.2.2 CT-1 steigert redoxreguliert die Proliferationsrate ES-Zell-abgeleiteter Herzmuskelzellen 38
3.2.3 CT-1 induziert die Bildung von ROI in ES-Zell-abgeleiteten Herzmuskelzellen 40
3.2.4 Durch CT-1 aktivierte Signalwege 43
3.2.4.1 Vorbemerkung 43
3.2.4.2 CT-1 aktiviert den JAK2-Signalweg 43
3.2.4.3 CT-1 aktiviert den STAT3-Signalweg 47
3.2.4.4 CT-1 aktiviert den ERK 1 / 2-Signalweg 52
3.2.4.5 CT-1 aktiviert den NFKB-Signalweg 55
3.2 5 CT-1 ist ohne EinfluB auf intrazelluläre Ca:' Iransienlen in ES-Zell-abgeleiteten
Herzmuskelzellen 58
4. Diskussion 59
4.1 Vorbemerkung 59
4.2 Die durch CT-1 induzierte Proliferationssteigerung ES-Zell-abgeleiteter
Kardiomyozyten ist redoxreguliert 59
4.3 CT-1 und die Abhängigkeit seiner endogenen Expression vom
Entwicklungsstadium der EB's 60
4.4 CT-1-induzierte Generierung von ROI 60
4.5 Durch CT-1 induzierte Signalwege sind redoxreguliert 62
4.5.1 Allgemeines 62
4.5.2 Der JAK-STAT-Signalweg 62
453 Der MAPK-Signalweg 64
4.5.4 Der INFicB-Signalweg 65
4.5.5 CT-1-induzierte Signalwegsaktivierung und ROI 66
4.6 Ca:'-Signale sind an CT-1-induzierter Signaltransduktion nicht
beteiligt 66
4.7 Zusammenfassung und Ausblick 68
4.7.1 Zusammenfassung u d 68
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