Produktion und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Interleukin-8:
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2004
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS i
TABELLENVERZEICHNIS ii
ABBILDUNGSVERZEICHNIS iii
1. EINLEITUNG 1
2. FRAGESTELLUNG 6
3. METHODEN 8
3.1. Herstellung von anti-IL-8-produzierenden Zellklonen 8
3.1.1 Gewinnung des Immunogens IL-8 8
3.1.2 Immunisierung von Balb-c-Mäusen gegen IL-8 8
3.1.3 Hybridisierung der immunisierten Maus-Myelomzellen mit
einer Balb-c-Maus-Myelomzelllinie 9
3.1.4 Selektion der anti-lL-8-Antikörper produzierenden Zellklone 10
3.2. Aufbereitung der monoklonalen anti-IL-8-Antikörper 11
3.2.1 Fraktionierte Proteinfällung der Zellkulturüberstände durch
Ammoniumsulfat 11 m
3.2.2 Konzentrierung und Dialyse der anti-IL-8-AK 11 ¦
3.2.3 Chromatographische Reinigung der anti-IL-8-Antikörper 11 1
3.2.4 Quantifizierung der HPLC-gereinigten anti-IL-8-Antikörper 12
3.2.5 Streptavidin-Biotin-Kopplung der anti-IL-8-Antikörper für den
Einsatz im ELISA-Verfahren 12
3.3. Analytische und präparative Auftrennung der anti-IL-8-
Antikörper 13
3.3.1 SDS-Page 13
3.3.2 Isoelektrische Fokussierung 14
3.3.3 Protein-Blotting 15
Inhaltsverzeichnis
3.4. Immunologische Nachweisverfahren zur
Charakterisierung der anti-IL-8-Antikörper 15
3.4.1 Western-Immunoblot 15
3.4.2 Dot-Immunoblot 16
3.4.3 Festphasen-ELISA 16
3.4.4 Sandwich-ELISA 17
3.4.5 Subklassen-Bestimmung 18
3.5. Immunchemische Verfahren 19
3.5.1 Immunzytologische Untersuchungen mit Hilfe von Zellkulturen 19
¦ Humane dermale Fibroblasten 19
¦ Humane Endothelzellen aus Nabelschnurvenen 20
¦ Humane primär kultivierte Keratinozyten 20
• Stimulationsansätze mit den drei Zelltypen 21
3.5.2 Immunhistologische Verfahren 21
4. ERGEBNISSE 23
4.1. Ergebnis der Immunisierung und Herstellung von anti-
IL-8-Antikörper 23
4.1.1 Isoelektrische Fokussierung und SDS-Page 24
4.2. Spezifität der einzelnen moAK 25
4.2.1 Reaktivität der moAK im Festphasen-ELISA 26
4.2.2 Reaktivität der moAK im Sandwich-ELISA 27
4.2.3 Reaktivität mit Schuppen-Extrakten 28
4.3. Reaktivität der moAK in der Immunhistologie, -Zytologie 30
4.3.1 Reaktivität der moAK in der Immunhistologie 30
4.3.2 Reaktivität der moAK in der Immunzytologie 30
Inhaltsverzeichnis
5. DISKUSSION 35
5.1. Reaktivität der verschiedenen anti-IL-8-AK 37
5.1.1 Reaktivität mit I L-8-Homologen anderer Spezies 37
5.1.2 Reaktivität mit nativem IL-8 38
5.1.3 Reaktivität mit IL-8-Varianten 38
5.1.4 Reakivität mit IL-8-verwandten humanen Chemokinen 41
5.2. Reaktivität der anti-IL-8-AK in der Immunzytologie und -histologie 43
5.2.1 Reaktivität in der Immunzytologie 43
5.2.2 Reaktivität in der Immunhistologie 44
6. ZUSAMMENFASSUNG 46
7. LITERATUR 48
8. ANHANG 57
9. DANKSAGUNG 60
10. LEBENSLAUF 61
Tabellenverzeichnis ji
TABELLENVERZEICHNIS
Tab.1: S.2 Synonyme für lnterleukin-8
Tab.2: S.3 Stimuli zur lnterteukin-8-Ausschüttung
Tab. 3: S.4 Die beiden größten Chemokin-Familien mit ihren Vertretern
Tab.4: S.25 Charakterisierung der moAK(1)
Tab.5: S.32 Charakterisierung der moAK (2)
Tab.6: S.35 Biologische Funktion von IL-8
Tab.7: S.36 Charakteristika von lnterieukin-8
Tab.8: S.40 Übersicht über die einzelnen moAK gegen IL-8, hier im Hause
Tab.9: S.41 Synonyme der Chemokin-Familie
Abbildunosverzeichnis ijj .
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb.1: S.24 Isoelektrische Fokussierung, charakteristisches Bandenmuster der
monoklonalen Antikörper
Abb.2: S.26 Reaktivität der monoklonalen Antikörper 25E8, 34B6 und 49H12 mit
IL-872AS und verwandten Chemokinen (je 50ng/Napf)
Abb.3: S.27 Hemmversuche zur Epitop-Bestimmung der verschiedenen
monoklonalen Antikörper
Abb.4: S.28 Sensitivitätsnachweis der moAK 25E8 und 52E8 im Sandwich-
ELISA
Abb.5: S.29 Immunreaktivität der moAK 49H12 und 25E8 mit Schuppen¬
material
Abb.6: S.29 Immunreaktivität des moAK 34B6 mit Schuppenmaterial
Abb.7: S.30 Immunzytologische Färbung von Endothelzellen (EC), Fibroblasten (F)
und Keratinozyten (KC) mit dem moAK 25E8
Abb.8: S.31 Quantifizierung der intrazytoplasmatisch positiven Zellen in
Abhängigkeit von der Stimulationsdauer (TNFa 100U/ml)
Abb.9: S.31 Quantifizierung des in den Kulturüberstand sezernierten IL-8
im ELISA in Abhängigkeit von der Stimulationsdauer (ng/ml)
|
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Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS i
TABELLENVERZEICHNIS ii
ABBILDUNGSVERZEICHNIS iii
1. EINLEITUNG 1
2. FRAGESTELLUNG 6
3. METHODEN 8
3.1. Herstellung von anti-IL-8-produzierenden Zellklonen 8
3.1.1 Gewinnung des Immunogens IL-8 8
3.1.2 Immunisierung von Balb-c-Mäusen gegen IL-8 8
3.1.3 Hybridisierung der immunisierten Maus-Myelomzellen mit
einer Balb-c-Maus-Myelomzelllinie 9
3.1.4 Selektion der anti-lL-8-Antikörper produzierenden Zellklone 10
3.2. Aufbereitung der monoklonalen anti-IL-8-Antikörper 11
3.2.1 Fraktionierte Proteinfällung der Zellkulturüberstände durch
Ammoniumsulfat 11 m
3.2.2 Konzentrierung und Dialyse der anti-IL-8-AK 11 ¦
3.2.3 Chromatographische Reinigung der anti-IL-8-Antikörper 11 1
3.2.4 Quantifizierung der HPLC-gereinigten anti-IL-8-Antikörper 12
3.2.5 Streptavidin-Biotin-Kopplung der anti-IL-8-Antikörper für den
Einsatz im ELISA-Verfahren 12
3.3. Analytische und präparative Auftrennung der anti-IL-8-
Antikörper 13
3.3.1 SDS-Page 13
3.3.2 Isoelektrische Fokussierung 14
3.3.3 Protein-Blotting 15
Inhaltsverzeichnis
3.4. Immunologische Nachweisverfahren zur
Charakterisierung der anti-IL-8-Antikörper 15
3.4.1 Western-Immunoblot 15
3.4.2 Dot-Immunoblot 16
3.4.3 Festphasen-ELISA 16
3.4.4 Sandwich-ELISA 17
3.4.5 Subklassen-Bestimmung 18
3.5. Immunchemische Verfahren 19
3.5.1 Immunzytologische Untersuchungen mit Hilfe von Zellkulturen 19
¦ Humane dermale Fibroblasten 19
¦ Humane Endothelzellen aus Nabelschnurvenen 20
¦ Humane primär kultivierte Keratinozyten 20
• Stimulationsansätze mit den drei Zelltypen 21
3.5.2 Immunhistologische Verfahren 21
4. ERGEBNISSE 23
4.1. Ergebnis der Immunisierung und Herstellung von anti-
IL-8-Antikörper 23
4.1.1 Isoelektrische Fokussierung und SDS-Page 24
4.2. Spezifität der einzelnen moAK 25
4.2.1 Reaktivität der moAK im Festphasen-ELISA 26
4.2.2 Reaktivität der moAK im Sandwich-ELISA 27
4.2.3 Reaktivität mit Schuppen-Extrakten 28
4.3. Reaktivität der moAK in der Immunhistologie, -Zytologie 30
4.3.1 Reaktivität der moAK in der Immunhistologie 30
4.3.2 Reaktivität der moAK in der Immunzytologie 30
Inhaltsverzeichnis
5. DISKUSSION 35
5.1. Reaktivität der verschiedenen anti-IL-8-AK 37
5.1.1 Reaktivität mit I L-8-Homologen anderer Spezies 37
5.1.2 Reaktivität mit nativem IL-8 38
5.1.3 Reaktivität mit IL-8-Varianten 38
5.1.4 Reakivität mit IL-8-verwandten humanen Chemokinen 41
5.2. Reaktivität der anti-IL-8-AK in der Immunzytologie und -histologie 43
5.2.1 Reaktivität in der Immunzytologie 43
5.2.2 Reaktivität in der Immunhistologie 44
6. ZUSAMMENFASSUNG 46
7. LITERATUR 48
8. ANHANG 57
9. DANKSAGUNG 60
10. LEBENSLAUF 61
Tabellenverzeichnis ji
TABELLENVERZEICHNIS
Tab.1: S.2 Synonyme für lnterleukin-8
Tab.2: S.3 Stimuli zur lnterteukin-8-Ausschüttung
Tab. 3: S.4 Die beiden größten Chemokin-Familien mit ihren Vertretern
Tab.4: S.25 Charakterisierung der moAK(1)
Tab.5: S.32 Charakterisierung der moAK (2)
Tab.6: S.35 Biologische Funktion von IL-8
Tab.7: S.36 Charakteristika von lnterieukin-8
Tab.8: S.40 Übersicht über die einzelnen moAK gegen IL-8, hier im Hause
Tab.9: S.41 Synonyme der Chemokin-Familie
Abbildunosverzeichnis ijj .
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb.1: S.24 Isoelektrische Fokussierung, charakteristisches Bandenmuster der
monoklonalen Antikörper
Abb.2: S.26 Reaktivität der monoklonalen Antikörper 25E8, 34B6 und 49H12 mit
IL-872AS und verwandten Chemokinen (je 50ng/Napf)
Abb.3: S.27 Hemmversuche zur Epitop-Bestimmung der verschiedenen
monoklonalen Antikörper
Abb.4: S.28 Sensitivitätsnachweis der moAK 25E8 und 52E8 im Sandwich-
ELISA
Abb.5: S.29 Immunreaktivität der moAK 49H12 und 25E8 mit Schuppen¬
material
Abb.6: S.29 Immunreaktivität des moAK 34B6 mit Schuppenmaterial
Abb.7: S.30 Immunzytologische Färbung von Endothelzellen (EC), Fibroblasten (F)
und Keratinozyten (KC) mit dem moAK 25E8
Abb.8: S.31 Quantifizierung der intrazytoplasmatisch positiven Zellen in
Abhängigkeit von der Stimulationsdauer (TNFa 100U/ml)
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