Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1):
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Microfilm Book |
| Language: | German |
| Published: |
2004
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Kiel, Univ., Diss., 2004 |
| Physical Description: | VIII, 63, V Bl. Ill., graph. Darst. |
Staff View
MARC
| LEADER | 00000nam a2200000 c 4500 | ||
|---|---|---|---|
| 001 | BV020868961 | ||
| 003 | DE-604 | ||
| 005 | 00000000000000.0 | ||
| 007 | he|bmb024bbcu | ||
| 008 | 051115s2004 gw ad|| bm||| 00||| ger d | ||
| 015 | |a 04,H11,2148 |2 dnb | ||
| 016 | 7 | |a 972332820 |2 DE-101 | |
| 035 | |a (OCoLC)255461477 | ||
| 035 | |a (DE-599)BVBBV020868961 | ||
| 040 | |a DE-604 |b ger |e rakddb | ||
| 041 | 0 | |a ger | |
| 044 | |a gw |c XA-DE | ||
| 049 | |a DE-19 |a DE-355 | ||
| 084 | |a 610 |2 sdnb | ||
| 100 | 1 | |a Sieke, Alexander |d 1975- |e Verfasser |0 (DE-588)12942093X |4 aut | |
| 245 | 1 | 0 | |a Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |c vorgelegt von Alexander Sieke |
| 264 | 1 | |c 2004 | |
| 300 | |a VIII, 63, V Bl. |b Ill., graph. Darst. | ||
| 336 | |b txt |2 rdacontent | ||
| 337 | |b h |2 rdamedia | ||
| 338 | |b he |2 rdacarrier | ||
| 500 | |a Kiel, Univ., Diss., 2004 | ||
| 533 | |a Mikroform-Ausgabe |d 2004 |e 1 Mikrofiche : 24x |n Mikrofiche-Ausg.: |n [Mikrofiche-Ausg.] |n Signatur des reproduzierten Kulturobjekts: DBL_x001C_2004 MF 935 |7 s2004 | ||
| 655 | 7 | |0 (DE-588)4113937-9 |a Hochschulschrift |2 gnd-content | |
| 776 | 0 | 8 | |i Reproduktion von |a Sieke, Alexander, 1975- |t Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |d 2004 |
| 856 | 4 | 2 | |m HBZ Datenaustausch |q application/pdf |u http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=014190739&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA |3 Inhaltsverzeichnis |
| 999 | |a oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-014190739 | ||
Record in the Search Index
| _version_ | 1804134593896382464 |
|---|---|
| adam_text | m
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das PACAP response gene 1 (PRG1) 1
1.2 Das humane PRG-1 -Homologe IEX-1 3
1.3 Regulation der PRG 1 -/ IEX-1 -Expression durch NFkB und p53 3
1.4 Die IEX-1 -Variante IEX-1L 5
1.5. Aufgabenstellung 7
2 Material und Methoden 8
2.1 Material 8
2.1.1 Chemikalien und deren Bezugsquellen 8
2.1.2 Spezielle Materialien 9
2.1.3 Antikörper 10
2.1.4 Plasmide und Bakterienstämme 11
2.1.5 Zellinien 11
2.1.6 Primer 11
2.2 Methoden 12
2.2.1 Zellkultur 12
2.2.2 Kultur von E. coli-Stämmen 13
2.2.3 Plasmid-DNA-Isolierung 14
2.2.4 Extraktion von Gesamtprotein aus der Zelle 14
2.2.5 Isolierung der Proteine aus dem Zellkern 14
2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 15
2.2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 15
2.2.8 DNA-Gelelektrophorese 15
2.2.9 Protein-Gelelektrophorese 17
2.2.10 Western Blotting und Immunodetektion 18
2.2.11 DNA-Restriktionsverdau 20
rv
2.2.12 DNA-Sequenzierung 20
2.2.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 20
2.2.14 Klonierung von PCR-und Restriktionsprodukten in Vektoren 21
2.2.15 Transformation von Exoli-Stämmen 22
2.2.16 Immunfluoreszenz 22
2.2.17 Nachweis apoptotischer Zellen 24
3 Ergebnisse 26
3.1 Untersuchung der IEX-1-Mutante IEX-1L 26
3.1.1 Generierung von IEX-1L in vitro 26
3.1.3 Einfluß der IEX-IL-Transfektionaufdie Apoptoseneigung von CHO-Zellen 33
3.2 Untersuchung der Verteilung von IEX-1 in HeLa-Zellen 35
3.2.1 Untersuchung des Verteilungsmusters des IEX-1/ GFP-Fusionsproteins 35
3.2.2 Untersuchung der Funktionsfähigkeit der NLS bei IEX-1 38
3.2.3 Untersuchung der Auswirkung einer N-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 39
3.2.4 Untersuchung der Auswirkung einer C-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 41
3.2.5 Untersuchung der Apoptose in GFP-Fusionsprotein-transfizierten HeLa-Zellen42
3.2.6 Verifizierung der GFP-Fusionsproteine und deren Verteilung durch indirekte
Immunfluoreszenzfärbung mit anti-IEX-1 -Antikörpern 42
3.2.7 Doppel-Immunfhioreszenzfärbung von IEX-1 und PML in HeLa-Zellen 43
4 Diskussion 44
4.1 Eigenschaften von ungespleifitem IEX-1L 44
4.1.1 IEX-1L- und IEX-1 weisen unter Kotransfektion einen gegensätzlich
veränderten Proteingehalt auf 44
4.1.2 IEX-1L besitzt keine eigenständige antiapoptotische Wirkung 45
4.2 Zelluläre Lokalisation von IEX-1 46
4.2.1. Die Kemlokalisationssequenz (NLS) ist eine wichtige Voraussetzung für die
Kemständikei t von IEX-1 47
V
4.2.2 Der N-Terminus von IEX-1 hat keinen Einfluss auf die Kernlokalisation bei
intakter NLS 48
4.2.3 Die Kemlokalisationssequenz von IEX-1 ist nicht abhängig vom intakten C-
Terminus 48
4.3 Identifizierung der IEX-1-assoziierten intranukleären Strukturen 49
5 Zusammenfassung 51
6 Literaturverzeichnis 55
7 Danksagung 62
8 Lebenslauf 63
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Genstruktur von PRG1/IEX-1 2
Abbildung 2: Darstellung der Sequenzen von IEX-1 und IEX-1L 27
Abbildung 3: Schritt 1 (Deletion von G344) 28
Abbildung 4: Schritt 2 (Deletion von G305) 29
Abbildung 5: Schritt 3 (Insertion von C214) 31
Abbildung 6: Kotransfektion und Proteinmengen von IEX-1 und
IEX-lLinCHO-Zellen 33
Abbildung 7: Einfluß von IEX-1/IEX-lL-Kotransfektion auf das
Apoptoseverhalten von CHO-Zellen 34
Abbildung 8: Wildtyp-und modifizierte IEX-1-Sequenzen 36
Abbildung 9: Westernblot mit Lysaten von IEX-1 bzw. GFP-IEX-1-
oder mock-transfizierten HeLa-Zellen 37
Abbildung 10: Unterschiedliche Verteilung von GFP-WT-IEX-1 und
GFP-ANLS-IEX-1 in Zellkern und Zytoplasma
transfizierter HeLa-Zellen 39
Abbildung 11: Unterschiedliche Verteilung von GFP-WT-IEX-1 und
GFP-ANT3,-IEX-1 in Zellkern und Zytoplasma
transfizierter HeLa-Zellen 40
|
| adam_txt |
m
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das PACAP response gene 1 (PRG1) 1
1.2 Das humane PRG-1 -Homologe IEX-1 3
1.3 Regulation der PRG 1 -/ IEX-1 -Expression durch NFkB und p53 3
1.4 Die IEX-1 -Variante IEX-1L 5
1.5. Aufgabenstellung 7
2 Material und Methoden 8
2.1 Material 8
2.1.1 Chemikalien und deren Bezugsquellen 8
2.1.2 Spezielle Materialien 9
2.1.3 Antikörper 10
2.1.4 Plasmide und Bakterienstämme 11
2.1.5 Zellinien 11
2.1.6 Primer 11
2.2 Methoden 12
2.2.1 Zellkultur 12
2.2.2 Kultur von E. coli-Stämmen 13
2.2.3 Plasmid-DNA-Isolierung 14
2.2.4 Extraktion von Gesamtprotein aus der Zelle 14
2.2.5 Isolierung der Proteine aus dem Zellkern 14
2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 15
2.2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 15
2.2.8 DNA-Gelelektrophorese 15
2.2.9 Protein-Gelelektrophorese 17
2.2.10 Western Blotting und Immunodetektion 18
2.2.11 DNA-Restriktionsverdau 20
rv
2.2.12 DNA-Sequenzierung 20
2.2.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 20
2.2.14 Klonierung von PCR-und Restriktionsprodukten in Vektoren 21
2.2.15 Transformation von Exoli-Stämmen 22
2.2.16 Immunfluoreszenz 22
2.2.17 Nachweis apoptotischer Zellen 24
3 Ergebnisse 26
3.1 Untersuchung der IEX-1-Mutante IEX-1L 26
3.1.1 Generierung von IEX-1L in vitro 26
3.1.3 Einfluß der IEX-IL-Transfektionaufdie Apoptoseneigung von CHO-Zellen 33
3.2 Untersuchung der Verteilung von IEX-1 in HeLa-Zellen 35
3.2.1 Untersuchung des Verteilungsmusters des IEX-1/ GFP-Fusionsproteins 35
3.2.2 Untersuchung der Funktionsfähigkeit der NLS bei IEX-1 38
3.2.3 Untersuchung der Auswirkung einer N-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 39
3.2.4 Untersuchung der Auswirkung einer C-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 41
3.2.5 Untersuchung der Apoptose in GFP-Fusionsprotein-transfizierten HeLa-Zellen42
3.2.6 Verifizierung der GFP-Fusionsproteine und deren Verteilung durch indirekte
Immunfluoreszenzfärbung mit anti-IEX-1 -Antikörpern 42
3.2.7 Doppel-Immunfhioreszenzfärbung von IEX-1 und PML in HeLa-Zellen 43
4 Diskussion 44
4.1 Eigenschaften von ungespleifitem IEX-1L 44
4.1.1 IEX-1L- und IEX-1 weisen unter Kotransfektion einen gegensätzlich
veränderten Proteingehalt auf 44
4.1.2 IEX-1L besitzt keine eigenständige antiapoptotische Wirkung 45
4.2 Zelluläre Lokalisation von IEX-1 46
4.2.1. Die Kemlokalisationssequenz (NLS) ist eine wichtige Voraussetzung für die
Kemständikei t von IEX-1 47
V
4.2.2 Der N-Terminus von IEX-1 hat keinen Einfluss auf die Kernlokalisation bei
intakter NLS 48
4.2.3 Die Kemlokalisationssequenz von IEX-1 ist nicht abhängig vom intakten C-
Terminus 48
4.3 Identifizierung der IEX-1-assoziierten intranukleären Strukturen 49
5 Zusammenfassung 51
6 Literaturverzeichnis 55
7 Danksagung 62
8 Lebenslauf 63
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Genstruktur von PRG1/IEX-1 2
Abbildung 2: Darstellung der Sequenzen von IEX-1 und IEX-1L 27
Abbildung 3: Schritt 1 (Deletion von G344) 28
Abbildung 4: Schritt 2 (Deletion von G305) 29
Abbildung 5: Schritt 3 (Insertion von C214) 31
Abbildung 6: Kotransfektion und Proteinmengen von IEX-1 und
IEX-lLinCHO-Zellen 33
Abbildung 7: Einfluß von IEX-1/IEX-lL-Kotransfektion auf das
Apoptoseverhalten von CHO-Zellen 34
Abbildung 8: Wildtyp-und modifizierte IEX-1-Sequenzen 36
Abbildung 9: Westernblot mit Lysaten von IEX-1 bzw. GFP-IEX-1-
oder mock-transfizierten HeLa-Zellen 37
Abbildung 10: Unterschiedliche Verteilung von GFP-WT-IEX-1 und
GFP-ANLS-IEX-1 in Zellkern und Zytoplasma
transfizierter HeLa-Zellen 39
Abbildung 11: Unterschiedliche Verteilung von GFP-WT-IEX-1 und
GFP-ANT3,-IEX-1 in Zellkern und Zytoplasma
transfizierter HeLa-Zellen 40 |
| any_adam_object | 1 |
| any_adam_object_boolean | 1 |
| author | Sieke, Alexander 1975- |
| author_GND | (DE-588)12942093X |
| author_facet | Sieke, Alexander 1975- |
| author_role | aut |
| author_sort | Sieke, Alexander 1975- |
| author_variant | a s as |
| building | Verbundindex |
| bvnumber | BV020868961 |
| ctrlnum | (OCoLC)255461477 (DE-599)BVBBV020868961 |
| discipline | Medizin |
| discipline_str_mv | Medizin |
| format | Microfilm Book |
| fullrecord | <?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><collection xmlns="http://www.loc.gov/MARC21/slim"><record><leader>01642nam a2200349 c 4500</leader><controlfield tag="001">BV020868961</controlfield><controlfield tag="003">DE-604</controlfield><controlfield tag="005">00000000000000.0</controlfield><controlfield tag="007">he|bmb024bbcu</controlfield><controlfield tag="008">051115s2004 gw ad|| bm||| 00||| ger d</controlfield><datafield tag="015" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">04,H11,2148</subfield><subfield code="2">dnb</subfield></datafield><datafield tag="016" ind1="7" ind2=" "><subfield code="a">972332820</subfield><subfield code="2">DE-101</subfield></datafield><datafield tag="035" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">(OCoLC)255461477</subfield></datafield><datafield tag="035" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">(DE-599)BVBBV020868961</subfield></datafield><datafield tag="040" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">DE-604</subfield><subfield code="b">ger</subfield><subfield code="e">rakddb</subfield></datafield><datafield tag="041" ind1="0" ind2=" "><subfield code="a">ger</subfield></datafield><datafield tag="044" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">gw</subfield><subfield code="c">XA-DE</subfield></datafield><datafield tag="049" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">DE-19</subfield><subfield code="a">DE-355</subfield></datafield><datafield tag="084" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">610</subfield><subfield code="2">sdnb</subfield></datafield><datafield tag="100" ind1="1" ind2=" "><subfield code="a">Sieke, Alexander</subfield><subfield code="d">1975-</subfield><subfield code="e">Verfasser</subfield><subfield code="0">(DE-588)12942093X</subfield><subfield code="4">aut</subfield></datafield><datafield tag="245" ind1="1" ind2="0"><subfield code="a">Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1)</subfield><subfield code="c">vorgelegt von Alexander Sieke</subfield></datafield><datafield tag="264" ind1=" " ind2="1"><subfield code="c">2004</subfield></datafield><datafield tag="300" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">VIII, 63, V Bl.</subfield><subfield code="b">Ill., graph. Darst.</subfield></datafield><datafield tag="336" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">txt</subfield><subfield code="2">rdacontent</subfield></datafield><datafield tag="337" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">h</subfield><subfield code="2">rdamedia</subfield></datafield><datafield tag="338" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">he</subfield><subfield code="2">rdacarrier</subfield></datafield><datafield tag="500" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">Kiel, Univ., Diss., 2004</subfield></datafield><datafield tag="533" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">Mikroform-Ausgabe</subfield><subfield code="d">2004</subfield><subfield code="e">1 Mikrofiche : 24x</subfield><subfield code="n">Mikrofiche-Ausg.:</subfield><subfield code="n">[Mikrofiche-Ausg.]</subfield><subfield code="n">Signatur des reproduzierten Kulturobjekts: DBL_x001C_2004 MF 935</subfield><subfield code="7">s2004</subfield></datafield><datafield tag="655" ind1=" " ind2="7"><subfield code="0">(DE-588)4113937-9</subfield><subfield code="a">Hochschulschrift</subfield><subfield code="2">gnd-content</subfield></datafield><datafield tag="776" ind1="0" ind2="8"><subfield code="i">Reproduktion von</subfield><subfield code="a">Sieke, Alexander, 1975-</subfield><subfield code="t">Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1)</subfield><subfield code="d">2004</subfield></datafield><datafield tag="856" ind1="4" ind2="2"><subfield code="m">HBZ Datenaustausch</subfield><subfield code="q">application/pdf</subfield><subfield code="u">http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=014190739&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA</subfield><subfield code="3">Inhaltsverzeichnis</subfield></datafield><datafield tag="999" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-014190739</subfield></datafield></record></collection> |
| genre | (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content |
| genre_facet | Hochschulschrift |
| id | DE-604.BV020868961 |
| illustrated | Illustrated |
| index_date | 2024-07-02T13:25:28Z |
| indexdate | 2024-07-09T20:27:05Z |
| institution | BVB |
| language | German |
| oai_aleph_id | oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-014190739 |
| oclc_num | 255461477 |
| open_access_boolean | |
| owner | DE-19 DE-BY-UBM DE-355 DE-BY-UBR |
| owner_facet | DE-19 DE-BY-UBM DE-355 DE-BY-UBR |
| physical | VIII, 63, V Bl. Ill., graph. Darst. |
| publishDate | 2004 |
| publishDateSearch | 2004 |
| publishDateSort | 2004 |
| record_format | marc |
| spelling | Sieke, Alexander 1975- Verfasser (DE-588)12942093X aut Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) vorgelegt von Alexander Sieke 2004 VIII, 63, V Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent h rdamedia he rdacarrier Kiel, Univ., Diss., 2004 Mikroform-Ausgabe 2004 1 Mikrofiche : 24x Mikrofiche-Ausg.: [Mikrofiche-Ausg.] Signatur des reproduzierten Kulturobjekts: DBL_x001C_2004 MF 935 s2004 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Reproduktion von Sieke, Alexander, 1975- Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) 2004 HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=014190739&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
| spellingShingle | Sieke, Alexander 1975- Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |
| subject_GND | (DE-588)4113937-9 |
| title | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |
| title_auth | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |
| title_exact_search | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |
| title_exact_search_txtP | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |
| title_full | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) vorgelegt von Alexander Sieke |
| title_fullStr | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) vorgelegt von Alexander Sieke |
| title_full_unstemmed | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) vorgelegt von Alexander Sieke |
| title_short | Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1) |
| title_sort | untersuchung der struktur funktions beziehung des pituitary adenylate cyclase activating polypeptide response gene 1 prg1 iex 1 |
| topic_facet | Hochschulschrift |
| url | http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=014190739&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA |
| work_keys_str_mv | AT siekealexander untersuchungderstrukturfunktionsbeziehungdespituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptideresponsegene1prg1iex1 |