Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung des Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Response Gene 1 (PRG1-IEX-1):
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2004
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|---|---|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das PACAP response gene 1 (PRG1) 1
1.2 Das humane PRG-1 -Homologe IEX-1 3
1.3 Regulation der PRG 1 -/ IEX-1 -Expression durch NFkB und p53 3
1.4 Die IEX-1 -Variante IEX-1L 5
1.5. Aufgabenstellung 7
2 Material und Methoden 8
2.1 Material 8
2.1.1 Chemikalien und deren Bezugsquellen 8
2.1.2 Spezielle Materialien 9
2.1.3 Antikörper 10
2.1.4 Plasmide und Bakterienstämme 11
2.1.5 Zellinien 11
2.1.6 Primer 11
2.2 Methoden 12
2.2.1 Zellkultur 12
2.2.2 Kultur von E. coli-Stämmen 13
2.2.3 Plasmid-DNA-Isolierung 14
2.2.4 Extraktion von Gesamtprotein aus der Zelle 14
2.2.5 Isolierung der Proteine aus dem Zellkern 14
2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 15
2.2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 15
2.2.8 DNA-Gelelektrophorese 15
2.2.9 Protein-Gelelektrophorese 17
2.2.10 Western Blotting und Immunodetektion 18
2.2.11 DNA-Restriktionsverdau 20
rv
2.2.12 DNA-Sequenzierung 20
2.2.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 20
2.2.14 Klonierung von PCR-und Restriktionsprodukten in Vektoren 21
2.2.15 Transformation von Exoli-Stämmen 22
2.2.16 Immunfluoreszenz 22
2.2.17 Nachweis apoptotischer Zellen 24
3 Ergebnisse 26
3.1 Untersuchung der IEX-1-Mutante IEX-1L 26
3.1.1 Generierung von IEX-1L in vitro 26
3.1.3 Einfluß der IEX-IL-Transfektionaufdie Apoptoseneigung von CHO-Zellen 33
3.2 Untersuchung der Verteilung von IEX-1 in HeLa-Zellen 35
3.2.1 Untersuchung des Verteilungsmusters des IEX-1/ GFP-Fusionsproteins 35
3.2.2 Untersuchung der Funktionsfähigkeit der NLS bei IEX-1 38
3.2.3 Untersuchung der Auswirkung einer N-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 39
3.2.4 Untersuchung der Auswirkung einer C-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 41
3.2.5 Untersuchung der Apoptose in GFP-Fusionsprotein-transfizierten HeLa-Zellen42
3.2.6 Verifizierung der GFP-Fusionsproteine und deren Verteilung durch indirekte
Immunfluoreszenzfärbung mit anti-IEX-1 -Antikörpern 42
3.2.7 Doppel-Immunfhioreszenzfärbung von IEX-1 und PML in HeLa-Zellen 43
4 Diskussion 44
4.1 Eigenschaften von ungespleifitem IEX-1L 44
4.1.1 IEX-1L- und IEX-1 weisen unter Kotransfektion einen gegensätzlich
veränderten Proteingehalt auf 44
4.1.2 IEX-1L besitzt keine eigenständige antiapoptotische Wirkung 45
4.2 Zelluläre Lokalisation von IEX-1 46
4.2.1. Die Kemlokalisationssequenz (NLS) ist eine wichtige Voraussetzung für die
Kemständikei t von IEX-1 47
V
4.2.2 Der N-Terminus von IEX-1 hat keinen Einfluss auf die Kernlokalisation bei
intakter NLS 48
4.2.3 Die Kemlokalisationssequenz von IEX-1 ist nicht abhängig vom intakten C-
Terminus 48
4.3 Identifizierung der IEX-1-assoziierten intranukleären Strukturen 49
5 Zusammenfassung 51
6 Literaturverzeichnis 55
7 Danksagung 62
8 Lebenslauf 63
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Genstruktur von PRG1/IEX-1 2
Abbildung 2: Darstellung der Sequenzen von IEX-1 und IEX-1L 27
Abbildung 3: Schritt 1 (Deletion von G344) 28
Abbildung 4: Schritt 2 (Deletion von G305) 29
Abbildung 5: Schritt 3 (Insertion von C214) 31
Abbildung 6: Kotransfektion und Proteinmengen von IEX-1 und
IEX-lLinCHO-Zellen 33
Abbildung 7: Einfluß von IEX-1/IEX-lL-Kotransfektion auf das
Apoptoseverhalten von CHO-Zellen 34
Abbildung 8: Wildtyp-und modifizierte IEX-1-Sequenzen 36
Abbildung 9: Westernblot mit Lysaten von IEX-1 bzw. GFP-IEX-1-
oder mock-transfizierten HeLa-Zellen 37
Abbildung 10: Unterschiedliche Verteilung von GFP-WT-IEX-1 und
GFP-ANLS-IEX-1 in Zellkern und Zytoplasma
transfizierter HeLa-Zellen 39
Abbildung 11: Unterschiedliche Verteilung von GFP-WT-IEX-1 und
GFP-ANT3,-IEX-1 in Zellkern und Zytoplasma
transfizierter HeLa-Zellen 40
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das PACAP response gene 1 (PRG1) 1
1.2 Das humane PRG-1 -Homologe IEX-1 3
1.3 Regulation der PRG 1 -/ IEX-1 -Expression durch NFkB und p53 3
1.4 Die IEX-1 -Variante IEX-1L 5
1.5. Aufgabenstellung 7
2 Material und Methoden 8
2.1 Material 8
2.1.1 Chemikalien und deren Bezugsquellen 8
2.1.2 Spezielle Materialien 9
2.1.3 Antikörper 10
2.1.4 Plasmide und Bakterienstämme 11
2.1.5 Zellinien 11
2.1.6 Primer 11
2.2 Methoden 12
2.2.1 Zellkultur 12
2.2.2 Kultur von E. coli-Stämmen 13
2.2.3 Plasmid-DNA-Isolierung 14
2.2.4 Extraktion von Gesamtprotein aus der Zelle 14
2.2.5 Isolierung der Proteine aus dem Zellkern 14
2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 15
2.2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 15
2.2.8 DNA-Gelelektrophorese 15
2.2.9 Protein-Gelelektrophorese 17
2.2.10 Western Blotting und Immunodetektion 18
2.2.11 DNA-Restriktionsverdau 20
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2.2.12 DNA-Sequenzierung 20
2.2.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 20
2.2.14 Klonierung von PCR-und Restriktionsprodukten in Vektoren 21
2.2.15 Transformation von Exoli-Stämmen 22
2.2.16 Immunfluoreszenz 22
2.2.17 Nachweis apoptotischer Zellen 24
3 Ergebnisse 26
3.1 Untersuchung der IEX-1-Mutante IEX-1L 26
3.1.1 Generierung von IEX-1L in vitro 26
3.1.3 Einfluß der IEX-IL-Transfektionaufdie Apoptoseneigung von CHO-Zellen 33
3.2 Untersuchung der Verteilung von IEX-1 in HeLa-Zellen 35
3.2.1 Untersuchung des Verteilungsmusters des IEX-1/ GFP-Fusionsproteins 35
3.2.2 Untersuchung der Funktionsfähigkeit der NLS bei IEX-1 38
3.2.3 Untersuchung der Auswirkung einer N-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 39
3.2.4 Untersuchung der Auswirkung einer C-terminalen Deletion in IEX-1 auf das
Verteilungsmuster 41
3.2.5 Untersuchung der Apoptose in GFP-Fusionsprotein-transfizierten HeLa-Zellen42
3.2.6 Verifizierung der GFP-Fusionsproteine und deren Verteilung durch indirekte
Immunfluoreszenzfärbung mit anti-IEX-1 -Antikörpern 42
3.2.7 Doppel-Immunfhioreszenzfärbung von IEX-1 und PML in HeLa-Zellen 43
4 Diskussion 44
4.1 Eigenschaften von ungespleifitem IEX-1L 44
4.1.1 IEX-1L- und IEX-1 weisen unter Kotransfektion einen gegensätzlich
veränderten Proteingehalt auf 44
4.1.2 IEX-1L besitzt keine eigenständige antiapoptotische Wirkung 45
4.2 Zelluläre Lokalisation von IEX-1 46
4.2.1. Die Kemlokalisationssequenz (NLS) ist eine wichtige Voraussetzung für die
Kemständikei t von IEX-1 47
V
4.2.2 Der N-Terminus von IEX-1 hat keinen Einfluss auf die Kernlokalisation bei
intakter NLS 48
4.2.3 Die Kemlokalisationssequenz von IEX-1 ist nicht abhängig vom intakten C-
Terminus 48
4.3 Identifizierung der IEX-1-assoziierten intranukleären Strukturen 49
5 Zusammenfassung 51
6 Literaturverzeichnis 55
7 Danksagung 62
8 Lebenslauf 63
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Genstruktur von PRG1/IEX-1 2
Abbildung 2: Darstellung der Sequenzen von IEX-1 und IEX-1L 27
Abbildung 3: Schritt 1 (Deletion von G344) 28
Abbildung 4: Schritt 2 (Deletion von G305) 29
Abbildung 5: Schritt 3 (Insertion von C214) 31
Abbildung 6: Kotransfektion und Proteinmengen von IEX-1 und
IEX-lLinCHO-Zellen 33
Abbildung 7: Einfluß von IEX-1/IEX-lL-Kotransfektion auf das
Apoptoseverhalten von CHO-Zellen 34
Abbildung 8: Wildtyp-und modifizierte IEX-1-Sequenzen 36
Abbildung 9: Westernblot mit Lysaten von IEX-1 bzw. GFP-IEX-1-
oder mock-transfizierten HeLa-Zellen 37
Abbildung 10: Unterschiedliche Verteilung von GFP-WT-IEX-1 und
GFP-ANLS-IEX-1 in Zellkern und Zytoplasma
transfizierter HeLa-Zellen 39
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