Immuntherapie maligner Gliome: Polynukleotid-Vakzinierung gegen ein Modellantigen
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2004
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INHALTSVERZEICHNIS
Seite
L ElNLETTUNG 1
1. Maligne Gliome 1
2. Polynukleotid-Vakzinierung / DNA-Vakzinierung 2
IL FRAGESTELLUNG 6
Hl. Material und Methoden 7
1. Zelllinien 7
1.1. Tumorzelllinie und Herkunft 7
1.2. Zellkuttur 7
1.3. Einfrieren und Auftauen von Zellen 7
2. Transfektionsvektoren 8
2.1. Vektor 8
2.2. Transfektion 8
2.2.1. Effectene™ 8
2.2.2. SuperFect™ 11
2.2.3. Kalziumphosphat 11
2.3. Isolation eines Klons 11
2.4. X-Gal-Färbung 12
3. Vakzinierungsvektoren 12
3.1. HisB Vektoren und Herstellung 12
3.2. Überprüfung 13
3.3. IL-12 Vektor 13
3.4. Plasmid Vervielfältigung 14
4. Tierversuche 15
4.1. Tierhaltung und Pflege 15
4.2. Prä- und intraoperative Anästhesie 15
4.3. Transkardiale Perfusion ^5
5. Tumorimplantation t6
5.1. Vorbereitung der Zellen 16
V
5.2. Implantation 16
6. Vakzinieaing -j 7
7. Auswertung 17
7.1. Fixierung und Schneiden der Hirne 17
7.2. Gelantinieren von Objektträgern 18
7.3. Färbungen 18
7.3.1. X-Gal-Färbung der Hirnschnitte 18
7.3.2. Kresylviolettblau-Färbung 18
7.3.3. Hämatoxylin-Eosin-Färbung 19
7.3.4. Immunhistochemie 19
7.3.4.1. Beschreibung der verwendeten 20
Antikörper
7.3.4.1.1. CD8 20
7.3.4.1.2. ED1 20
7.3.4.1.3. Iba1 20
7.4. Morphometrische Auswertung 20
7.5. CTL-Assay 21
7.6. Chrom-Release 21
8. Statistik 22
IV. Ergebnisse 23
1. Optimierung der Transfektion zur Herstellung einer 23
Modellantigen exprimierenden Zelllinie
2. Modifizierung der Expressionsvektoren (Typ pcDNA3.1) 23
3. Inhibierung intrazerebralen Tumorwachstums 25
durch DNA-Vakzinierung
3.1. Wirkung von IL-12 29
4. Nachweis CD8 positiver Zellen 31
5. Spezifische Lyse durch zytotoxische T-Zelle 33
6. Untersuchung der mikroglialen Reaktion 34
VI
V. DISKUSSION 38
1. Intracerebrales Modell 38
2. Effekt der DNA-Vakzinierung auf Rattengliosarkome 39
3. Immunhistochemische und funktioneile 40
in vrtro-Untersuchungen
4. Ausblick und klinische Relevanz 42
VI. ZUSAMMENFASSUNG 44
VII. LITERATURVERZEICHNIS 45
VIII. DANKSAGUNG 52
IX CURRICULUMVITAE 53
|
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IV
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
L ElNLETTUNG 1
1. Maligne Gliome 1
2. Polynukleotid-Vakzinierung / DNA-Vakzinierung 2
IL FRAGESTELLUNG 6
Hl. Material und Methoden 7
1. Zelllinien 7
1.1. Tumorzelllinie und Herkunft 7
1.2. Zellkuttur 7
1.3. Einfrieren und Auftauen von Zellen 7
2. Transfektionsvektoren 8
2.1. Vektor 8
2.2. Transfektion 8
2.2.1. Effectene™ 8
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2.2.3. Kalziumphosphat 11
2.3. Isolation eines Klons 11
2.4. X-Gal-Färbung 12
3. Vakzinierungsvektoren 12
3.1. HisB Vektoren und Herstellung 12
3.2. Überprüfung 13
3.3. IL-12 Vektor 13
3.4. Plasmid Vervielfältigung 14
4. Tierversuche 15
4.1. Tierhaltung und Pflege 15
4.2. Prä- und intraoperative Anästhesie 15
4.3. Transkardiale Perfusion ^5
5. Tumorimplantation 't6
5.1. Vorbereitung der Zellen 16
V
5.2. Implantation 16
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7. Auswertung 17
7.1. Fixierung und Schneiden der Hirne 17
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7.3.1. X-Gal-Färbung der Hirnschnitte 18
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7.3.4. Immunhistochemie 19
7.3.4.1. Beschreibung der verwendeten 20
Antikörper
7.3.4.1.1. CD8 20
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7.4. Morphometrische Auswertung 20
7.5. CTL-Assay 21
7.6. Chrom-Release 21
8. Statistik 22
IV. Ergebnisse 23
1. Optimierung der Transfektion zur Herstellung einer 23
Modellantigen exprimierenden Zelllinie
2. Modifizierung der Expressionsvektoren (Typ pcDNA3.1) 23
3. Inhibierung intrazerebralen Tumorwachstums 25
durch DNA-Vakzinierung
3.1. Wirkung von IL-12 29
4. Nachweis CD8 positiver Zellen 31
5. Spezifische Lyse durch zytotoxische T-Zelle 33
6. Untersuchung der mikroglialen Reaktion 34
VI
V. DISKUSSION 38
1. Intracerebrales Modell 38
2. Effekt der DNA-Vakzinierung auf Rattengliosarkome 39
3. Immunhistochemische und funktioneile 40
in vrtro-Untersuchungen
4. Ausblick und klinische Relevanz 42
VI. ZUSAMMENFASSUNG 44
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