Modulation der Genexpression inflammatorischer Mediatoren durch einen EndothelinA-Rezeptorantagonisten bei Pankreastransplantation und Leberischämie im Schweinemodell:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Aktuelle Probleme der Organtransplantation 1
1.1.1 Gegenwärtige Situation in der Klinik 1
1.1.2 Der Ischämie-Reperfusions-Schaden 2
1.2 Struktur und Physiologie des Endothelins 5
1.2.1 Erstbeschreibung und Molekularstruktur 5
1.2.2 Endothelin-Biosynthese 6
1.2.3 Regulation der Endothelinsynthese 8
1.2.4 Endothelin-Rezeptoren 9
1.2.5 Biologische Wirkungen 9
1.2.6 Endothelin und Pankreas 11
1.2.7 Endothelin und Leber 12
1.2.8 ET-Rezeptorantagonisten 13
1.2.9 Die Rolle des Stickstoffmonoxids und seiner Synthasen 14
1.3 Zielsetzung und Fragestellung 15
2 Material und Methodik
2.1 Tiermodell 17
2.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung 17
2.1.2 Präoperative Vorbereitung und Anästhesie 18
2.1.3 Operative Techniken 18
2.1.3.1 Zervikale Gefäßpräparation und Kanülierung 18
2.1.3.2 Heterotope Pankreastransplantation 19
2.1.3.2.1 Spenderoperation (Pankreasexplantation) 19
2.1.3.2.2 Empfängeroperation (Pankreasimplantation) 20
2.1.3.2.3 Immunsuppression 20
2.1.3.3 Leberischämie-Operation 21
2.1.3.4 Relaparotomien 22
2.1.4 Postoperative Überwachung 22
2.2 Experimentelle Gruppen und Protokolle 22
2.3 Der EndothelinA Rezeptorantagonist 23
2.4 Molekularbiologische Methoden 24
2.4.1 RNA-Isolierung 24
2.4.2 Reverse Transkription 25
2.4.3 TaqMan Primer- und Sondensequenzen 26
2.4.4 Primer zur Herstellung von Plasmidstandards 27
2.4.5 Primerkontrolle in der PCR und elektrophoretischer
Produktnachweis 27
2.4.6 Aufreinigung des PCR-Produkts 28
2.4.7 Klonierung 28
2.4.7.1 Ligation 28
2.4.7.2 Transformation 29
2.4.7.3 Mini Prep 29
2.4.7.4 Maxi Prep 30
2.4.8 Sequenzierung 31
2.4.9 Linearisierung und Quantifizierung der Vektor-DNA 31
2.4.10 Anfertigung der Standardverdünnungen für die TaqMan PCR 32
2.4.11 Funktionsprinzip der TaqMan PCR 33
2.4.12 Fluorogene PCR-Sonden und ihre Farbstoffe 35
2.4.13 Verwendete Materialien für die TaqMan-PCR 36
2.4.14 Berechnung der Expressionsveränderungen 37
2.5 Serum Chemie 38
2.5.1 Klinische Chemie 38
2.5.1.1 Pankreasfunktionsparameter 38
2.5.1.2 Leberfunktionsparameter 38
2.5.2 ELISA-Tests 39
2.5.2.1 Endothelin-1 39
2.5.2.2 Trypsinogen Activation Peptide 39
2.6 Statistische Auswertung 40
3 Ergebnisse
3.1 Pankreastransplantation 41
3.1.1 Transplantationserfolg 41
3.1.2 Klinisch-chemische Parameter 41
3.1.2.1 Amylase und Lipase 41
3.1.2.2 C-Reaktives Protein 43
3.1.2.3Trypsinogen Activation Peptide 43
3.1.2.4 Plasma Endothelin-1 44
3.1.3 Einfluss der Pankreastransplantation auf die Genexpression 45
3.2 Leberischämie 47
3.2.1 Operationserfolg 47
3.2.2 Klinisch-chemische Parameter 47
3.2.2.1 ASAT, ALAT, GLDH und AP 47
3.2.2.2 Plasma ET-1 50
3.2.3 Einfluss der Leberischämie auf die Genexpression 51
4 Diskussion
4.1 Methodische Fragen 53
4.1.1 Experimentelle Versuchsansätze 53
4.1.2 Auswahl der Versuchstiere 54
4.1.3 Pankreastransplantation 55
4.1.4 Leberischämie 56
4.1.5 Quantitative real-time RT-PCR 58
4.2 Ergebnisse 59
4.2.1 Klinisch-chemische Untersuchungen 59
4.2.1.1 Pankreastransplantation 59
4.2.1.2 Leberischämie 60
4.2.2 ET- Konzentrationskinetik im Ischämie-Reperfusionsmodell 60
4.2.2.1 Pankreastransplantation 62
4.2.2.2 Leberischämie 62
4.2.3 Quantitative Genexpression 63
4.2.3.1 Expression des Endothelin-Systems 63
4.2.3.2 Expression der eNOS 65
4.2.3.3 Expression der Zytokine 66
5 Zusammenfassung 72
6 Literaturverzeichnis 75
7 Anhang 91
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Aktuelle Probleme der Organtransplantation 1
1.1.1 Gegenwärtige Situation in der Klinik 1
1.1.2 Der Ischämie-Reperfusions-Schaden 2
1.2 Struktur und Physiologie des Endothelins 5
1.2.1 Erstbeschreibung und Molekularstruktur 5
1.2.2 Endothelin-Biosynthese 6
1.2.3 Regulation der Endothelinsynthese 8
1.2.4 Endothelin-Rezeptoren 9
1.2.5 Biologische Wirkungen 9
1.2.6 Endothelin und Pankreas 11
1.2.7 Endothelin und Leber 12
1.2.8 ET-Rezeptorantagonisten 13
1.2.9 Die Rolle des Stickstoffmonoxids und seiner Synthasen 14
1.3 Zielsetzung und Fragestellung 15
2 Material und Methodik
2.1 Tiermodell 17
2.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung 17
2.1.2 Präoperative Vorbereitung und Anästhesie 18
2.1.3 Operative Techniken 18
2.1.3.1 Zervikale Gefäßpräparation und Kanülierung 18
2.1.3.2 Heterotope Pankreastransplantation 19
2.1.3.2.1 Spenderoperation (Pankreasexplantation) 19
2.1.3.2.2 Empfängeroperation (Pankreasimplantation) 20
2.1.3.2.3 Immunsuppression 20
2.1.3.3 Leberischämie-Operation 21
2.1.3.4 Relaparotomien 22
2.1.4 Postoperative Überwachung 22
2.2 Experimentelle Gruppen und Protokolle 22
2.3 Der EndothelinA Rezeptorantagonist 23
2.4 Molekularbiologische Methoden 24
2.4.1 RNA-Isolierung 24
2.4.2 Reverse Transkription 25
2.4.3 TaqMan Primer- und Sondensequenzen 26
2.4.4 Primer zur Herstellung von Plasmidstandards 27
2.4.5 Primerkontrolle in der PCR und elektrophoretischer
Produktnachweis 27
2.4.6 Aufreinigung des PCR-Produkts 28
2.4.7 Klonierung 28
2.4.7.1 Ligation 28
2.4.7.2 Transformation 29
2.4.7.3 Mini Prep 29
2.4.7.4 Maxi Prep 30
2.4.8 Sequenzierung 31
2.4.9 Linearisierung und Quantifizierung der Vektor-DNA 31
2.4.10 Anfertigung der Standardverdünnungen für die TaqMan PCR 32
2.4.11 Funktionsprinzip der TaqMan PCR 33
2.4.12 Fluorogene PCR-Sonden und ihre Farbstoffe 35
2.4.13 Verwendete Materialien für die TaqMan-PCR 36
2.4.14 Berechnung der Expressionsveränderungen 37
2.5 Serum Chemie 38
2.5.1 Klinische Chemie 38
2.5.1.1 Pankreasfunktionsparameter 38
2.5.1.2 Leberfunktionsparameter 38
2.5.2 ELISA-Tests 39
2.5.2.1 Endothelin-1 39
2.5.2.2 Trypsinogen Activation Peptide 39
2.6 Statistische Auswertung 40
3 Ergebnisse
3.1 Pankreastransplantation 41
3.1.1 Transplantationserfolg 41
3.1.2 Klinisch-chemische Parameter 41
3.1.2.1 Amylase und Lipase 41
3.1.2.2 C-Reaktives Protein 43
3.1.2.3Trypsinogen Activation Peptide 43
3.1.2.4 Plasma Endothelin-1 44
3.1.3 Einfluss der Pankreastransplantation auf die Genexpression 45
3.2 Leberischämie 47
3.2.1 Operationserfolg 47
3.2.2 Klinisch-chemische Parameter 47
3.2.2.1 ASAT, ALAT, GLDH und AP 47
3.2.2.2 Plasma ET-1 50
3.2.3 Einfluss der Leberischämie auf die Genexpression 51
4 Diskussion
4.1 Methodische Fragen 53
4.1.1 Experimentelle Versuchsansätze 53
4.1.2 Auswahl der Versuchstiere 54
4.1.3 Pankreastransplantation 55
4.1.4 Leberischämie 56
4.1.5 Quantitative real-time RT-PCR 58
4.2 Ergebnisse 59
4.2.1 Klinisch-chemische Untersuchungen 59
4.2.1.1 Pankreastransplantation 59
4.2.1.2 Leberischämie 60
4.2.2 ET- Konzentrationskinetik im Ischämie-Reperfusionsmodell 60
4.2.2.1 Pankreastransplantation 62
4.2.2.2 Leberischämie 62
4.2.3 Quantitative Genexpression 63
4.2.3.1 Expression des Endothelin-Systems 63
4.2.3.2 Expression der eNOS 65
4.2.3.3 Expression der Zytokine 66
5 Zusammenfassung 72
6 Literaturverzeichnis 75
7 Anhang 91 |
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