LOH-Analyse an Chromosom 17,9 und 8 am Urothel von Patienten ohne Harnblasentumoranamnese:
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2005
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|---|---|
| adam_text | 1 EINLEITUNG 3
1.1 Entwicklung der Harnblase. .3
1.2 Anatomie der Harnblase 4
1.2.1 Makroskopische Anatomie 4
1.2.2 Mikroskopische Anatomie 5
1.3 Das Harnblasenkarzinom 6
1.3.1 Epidemiologie 6
1.3.2 Ätiologie und Pathogenese 7
1.3.3 Lokalisation 8
1.3.4 Histopathologie 10
1.3.4.1 Flache Urothelläsionen 11
1.3.4.2 Nichtinvasive Urotheltumoren 12
1.3.4.3 Invasive Karzinome 12
1.3.5 TNM-Klassifikation 12
1.3.6 Molekulargenetik des Harnblasenkarzinoms 14
1.3.6.1 Alterationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen 14
1.3.6.2 Chromosomale Veränderungen im Verlauf der Harnblasenkarzinogenese 16
1.3.6.3 Deletionsanalyse mittels Mikrosatellitenmarkern (LOH-Analyse) 18
1.3.6.4 Mehrstufenkarzinogenese des Hantblasenkarzinoms 19
1.3.6.5 Theorien zur multifokalen Tumorentstehung: Monoklonal vs. oligoklonal 21
1.3.6.6 Genetische Alterationen in Präneoplasien 23
1.4 Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 24
2 MATERIAL 27
2.1 PatfentenkollektiT 27
2.2 Laborgeräte 28
2 J Chemikalien und Enzyme 29
2.3.1 Chemikalien 29
2.3.2 Enzyme 30
2.4 Puffer und Losungen 30
2.4.1 Allgemeine Lösungen 30
2.4.2 HE-Färbung 30
2.4.3 Methylenblaulösung 31
2.4.4 DNA-Isolierung aus Gewebe 31
2.4.5 Amplifikation genomischer DNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR) 31
2.4.6 Agarose-Gelelektrophorese 32
2.4.7 Polyacrylamid-Gelelektrophorese(PAA-Gelelektrophorese) 32
2.4.8 Silberfärbung 33
25 Verwendete Oligonukleotidprimer 34
2.5.1 Tabelle der Primer 34
3 METHODEN 35
3.1 Zusammenstellung des Fallmaterials und Identifizierung der Urothelregionen 35
3.2 Gewinnung von DNA aus Paraffinmaterial 36
3.2.1 Herstellung von Paraffinschnitten 36
3.2.2 Entparaffinieren der Gewebeschnitte 37
3.2.3 HE-Färbung der Referenzschnirte 37
3.2.4 Manuelle Mikrodissektion des Materials 38
3.2.1 DNA-Isolierung aus mikrodisseziertem Material 40
3.3 Qualität«- und Quantitätsabschätzung der verwendeten DNA mittels
Agarosegelelektophorese 41
3.4 Durchfuhrung der LOH-Analyse mittels Mikrosatellitenmarkern 42
3.4.1 In-vitro-Amplifikation genomischer DNA mittels PCR 42
3.4.1.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 42
3.4.1.2 Anwendung der PCR für die LOH-Analyse 43
3.4.1.3 PEP-PCR 46
3.4.1.4 Oradienten-PCR für Primer D9S156 48
3.4.2 Auftrennung der PCR-Produkte mittels PAA-Gelelektrophorese 49
3.5 Silberßrbung der PAA-Gele 51
3.6 Interpretation der PAA-Gele 52
4 ERGEBNISSE 54
4.1 Ergebnisse der LOH-Analyse 54
5 DISKUSSION 57
5.1 Diskussion der Fragestellung 57
5.2 Diskussion des Materials 57
5.3 Diskussion der Methoden 59
5.3.1 Gefahr der Verunreinigung des Materials 59
5.3.2 Gefahr der präferentiellen Amplifizierung 60
5.3.3 Weitere mögliche Fehlerquellen bei der LOH-Analyse 61
5.3.4 Verwendung schlecht tnterpretierbarer Marker 62
5.4 Diskussion der Ergebnisse 63
6 ZUSAMMENFASSUNG 69
7 ANHANG 70
7.1 Abkürzungsverzeichnis 70
7.2 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 72
73 Danksagung 73
7 4 T^hpnclniif 74
7.5 Publikationen 75
7.6 Literaturverzeichnis 76
2
|
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1 EINLEITUNG 3
1.1 Entwicklung der Harnblase. .3
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1.2.1 Makroskopische Anatomie 4
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1.3.3 Lokalisation 8
1.3.4 Histopathologie 10
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1.3.4.3 Invasive Karzinome 12
1.3.5 TNM-Klassifikation 12
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1.3.6.1 Alterationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen 14
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1.3.6.3 Deletionsanalyse mittels Mikrosatellitenmarkern (LOH-Analyse) 18
1.3.6.4 Mehrstufenkarzinogenese des Hantblasenkarzinoms 19
1.3.6.5 Theorien zur multifokalen Tumorentstehung: Monoklonal vs. oligoklonal 21
1.3.6.6 Genetische Alterationen in Präneoplasien 23
1.4 Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 24
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2.1 PatfentenkollektiT 27
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2 J Chemikalien und Enzyme 29
2.3.1 Chemikalien 29
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2.4.5 Amplifikation genomischer DNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR) 31
2.4.6 Agarose-Gelelektrophorese 32
2.4.7 Polyacrylamid-Gelelektrophorese(PAA-Gelelektrophorese) 32
2.4.8 Silberfärbung 33
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2.5.1 Tabelle der Primer 34
3 METHODEN 35
3.1 Zusammenstellung des Fallmaterials und Identifizierung der Urothelregionen 35
3.2 Gewinnung von DNA aus Paraffinmaterial 36
3.2.1 Herstellung von Paraffinschnitten 36
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3.2.3 HE-Färbung der Referenzschnirte 37
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Agarosegelelektophorese 41
3.4 Durchfuhrung der LOH-Analyse mittels Mikrosatellitenmarkern 42
3.4.1 In-vitro-Amplifikation genomischer DNA mittels PCR 42
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4.1 Ergebnisse der LOH-Analyse 54
5 DISKUSSION 57
5.1 Diskussion der Fragestellung 57
5.2 Diskussion des Materials 57
5.3 Diskussion der Methoden 59
5.3.1 Gefahr der Verunreinigung des Materials 59
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5.4 Diskussion der Ergebnisse 63
6 ZUSAMMENFASSUNG 69
7 ANHANG 70
7.1 Abkürzungsverzeichnis 70
7.2 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 72
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