Isolierung und Charakterisierung neuer Viren von Hyperthermophilen:
Gespeichert in:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis l
Inhaltsverzeichnis
I.Einleitung 1
II. Material und Methoden 11
1. Bezugsquellen von verwendeten Substanzen 11
1.1 Chemikalien 11
1.2 Enzyme, Plasmide und Reaktionskits 12
1.3PCR-Primer 12
1.5 Größenstandards 13
1.6 Geräte 13
1.7 Glasgeräte 14
1.8 Verbrauchsmaterialien 14
1.9 Verwendete Organismen und Viren 14
1.10 Herkunft der Originalproben 15
2. Allgemein verwendete Puffer und Lösungen 15
3. Medien, Zusätze und Sterilisation 17
3.1 LB-Medium (Eschehchia co//-Medium, Miller, 1972) 17
3.2 Alien-Medium YF (für kontinuierlichen Chemostat, Eis, 1999) 18
3.3 Sulfolobales-Medium (nach Allen etai, 1959; Brock etal., 1972; modifiziert) 19
3.5 Gelriteplatten für Einzelkolonien von Acidianus 20
3.6 Gelriteplatten für Hemmtests 20
3.7 Sterilisation 20
4. Kultivierung der verwendeten Organismen 20
4.1 Eschehchia coli 20
4.2 Pyrobaculum 20
4.3 Chemostat 21
4.4 Aerobe Anzucht der Sulfolobales 21
4.5 Anaerobe Anzucht von Acidianus 21
4.6 Kultivierung im Großmalistab 21
4.7 Mikroskopie und Lebend-Tot-Färbung 22
4.8 Gesamt-Zellzahl 22
4.9 Konservierung 22
5. Isolierung von S-Layer, Membranen und Zellanhängen 22
5.1 S-Layer-Isolierung und Membranisolierung 22
5.2 Isolierung von Zellanhängen 23
6. Manipulation an Viren 23
6.1 Virus-Isolierung 23
6.1.1 CsCI-Gradient 23
6.1.2 Ultrafiltration 23
6.2 Viruspräparation aus Zellkulturen 23
6.3 Virus-Infektion 24
6.4 Tropftest 24
6.5 Plaquetest 24
6.6 Quantifizierung von Viruspartikeln 25
6.7 Dialyse 25
7. Elektronenmikroskopie 25
7.1 Vorbereitung der Proben 25
7.1.1 Negativkontrastierung 25
7.1.2 Bedampfung mit Platin 25
7.1.3 Gefrierätzung 26
7.2 Elektronenmikroskopische Betrachtung der Präparate 26
7.3 Dreidimensionale Rekonstruktion der Viren durch Elektronentomographie 26
8. Manipulation an Nukleinsäure 27
Inhaltsverzeichnis M
8.1 Herstellung von gebrauchsfertigem Aqua Phenol 27
8.2 Konzentrationsbestimmung 27
8.3 Isolierung von DNA aus Zellen bzw. von Gesamt-DNA aus infizierten Zellen 27
8.4 Virus-DNA-Präparation 27
8.5 Isolierung von viraler ccc-DNA nach alkalischer Lyse (Birnboim und Doly, 1979;
Sambrook etal., 1989; modifiziert) 28
8.6 Restriktionsendonukleasenverdau 28
8.7 Polymerase-Ketten-Reaktion 28
8.8 Gelelektrophorese 29
8.9 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen 29
8.10 Ligation, Klonierung und Plasmidpräparation 30
8.10.1 Herstellung kompetenter Zellen 30
8.10.2 Ligation 30
8.10.3 Transformation von E coli 30
8.10.4 Plasmidpräparation 31
8.11 Sequenzierung von PCR-Produkten, Plasmid-DNA und Virus-Genomen 31
8.12 Sequenzdaten-Auswertung 31
8.13Southern-Hybridisierung 32
9. Proteinchemische Methoden 33
9.1 Konzentrationsbestimmung 33
9.2 Virus-Gesamt-Protein und Zeil-Protein 33
9.3 SDS-PAGE nach Laemmli (1970) 33
9.4 Färbung der Proteinbanden 33
9.4.1 Coomassie*-Färbung 33
9.4.2 Silber-Färbung (Blum etal., 1987) 34
9.4.3 Periodat-Schiff-Färbung (PAS-Färbung) (Segrest und Jackson, 1972) 34
9.5 Protein-Sequenzierung und -Detektion 34
9.5.1 Transfer von Protein auf PVDF-Membranen 34
9.5.2 N-terminale Sequenzierung 34
9.5.3 Immunologischer Nachweis des His-Tag 35
9.5.4 Immunologischer Nachweis mit spezifischen Antikörpern 35
9.6 Expression von rekombinantem Protein in £. coli 36
9.7 Reinigung von rekombinanten Protein mit His-Tag 36
9.8 Reinigung über Hitzeschritt und Superdex200 37
9.9 Assemblierung von gereinigtem ARV1-Hüll-Protein 37
9.10 Assemblierung von gereinigtem ATV-ORF800-Protein 37
10. Lipidanalyse 37
III. Ergebnisse und Diskussion 38
A. Untersuchung einer geothermal erhitzten Quelle aus dem
Yellowstone National Park/USA 38
1. Diversität der VLPs und Mikroorganismen in einer Quelle aus dem Yellowstone
National Park/USA 38
1.1 Ergebnisse 38
1.1.1 Diversität von VLPs im kontinuierlichen Chemostat 38
1.1.2 Diversität der Mikroorganismen im kontinuierlichen Chemostat 40
1.2 Diskussion 41
2. Pyrobaculum spherical Virus, PSV (eine neue Virus-Familie; die „Globuloviridae )...43
2.1 Ergebnisse 43
2.1.1 Infektionsversuche 43
2.1.2 Morphologie von PSV 44
2.1.3 Proteine und Upidevon PSV 46
2.1.4 Virus-Wirt-Beziehung 48
2.1.5 Genom von PSV 49
2.2 Diskussion 50
Inhaltsverzeichnis J!i
B. Untersuchung einer geothermal erhitzten Quelle aus Pozzuoli/
Italien 52
1. Diversität der Viren in einer Quelle aus Pozzuoli/Italien 52
1.1 Ergebnisse 52
1.1.1 Diversität der VLPs in den Anreicherungen 52
1.1.2 Diversität der Mikroorganismen in den Anreicherungen 53
1.1.3 VLP produzierende Stämme 54
1.1.4 Infektiösität der VLPs, Virus-Wirte 54
1.2 Diskussion 55
2. Acidianus rod-shaped Virus, ARV1 (Virus-Familie Rudiviridae) 57
2.1 Ergebnisse 57
2.1.1 Reinigung von ARV1 57
2.1.2 Wirte 57
2.1.3 Struktur von ARV1 57
2.1.4 Virus-Wirt-Interaktionen 60
2.1.5 Proteine von ARV1 61
2.1.6 Das Genom von ARV1 62
2.1.7 Heterologe Expression und Assemblierung des ARV1-Hüll-Proteins 64
2.1.7.1 Klonierung, heterologe Expression und Reinigung 64
2.1.7.2 Immunmarkierung mit ARV1-Hüll-Protein-spezifischem Antikörper 65
2.1.7.3 Assemblierung des rekombinanten ARV1-Hüll-Proteins 66
2.2 Diskussion 66
3. Acidianus filamentous Virus 2, AFV2 (Virus-Familie Lipothrixviridae) 70
3.1 Ergebnisse 70
3.1.1 Reinigung von AFV2 und Wirts-Spektrum 70
3.1.2 Struktur von AFV2 70
3.1.3 Proteine und Lipide von AFV2 72
3.1.4 Persistenz von AFV2 72
3.1.5 Das Genom von AFV2 73
3.2 Diskussion 74
4. Acidianus filamentous Virus 3, AFV3 (Virus-Familie Lipothrixviridae) 76
4.1 Ergebnisse 76
4.1.1 Reinigung von AFV3 und Wirts-Spektrum 76
4.1.2 Struktur von AFV3 76
4.1.3 Proteine und Lipide von AFV3 79
4.1.4 Das Genom von AFV3 79
4.2 Diskussion 81
5. Acidianus bottle-shaped Virus, ABV (neue Virus-Familie: jUmpullaviridae ) 82
5.1 Ergebnisse 82
5.1.1 Reinigung von ABV 82
5.1.2 Wirts-Spektrum von ABV 82
5.1.3 Virus-Wirt-Interaktionen 83
5.1.4 Struktur von ABV 83
5.1.5 Proteine von ABV 88
5.1.6 Genom von ABV 88
5.2 Diskussion 88
6. Acidianus two-tailed Virus, ATV (neue Virus-Familie: „Bicaudaviridae ) 90
6.1 Ergebnisse 90
6.1.1 Reinigung von ATV 90
6.1.2 Wirts-Spektrum und extrazelluläre Entwicklung von ATV 90
6.1.3 Einfluss von ATV auf das Wachstum von A convivator 91
6.1.4 Struktur von ATV 92
6.1.5 Infektiösität beider Virus-Formen 96
6.1.6 Proteine und Lipide von ATV 97
6.1.7 Genom von ATV 99
Inhaltsverzeichnis [V
6.1.8 Integration von ATV ins Wirts-Genom von JK. convivatoi 100
6.1.9 Heterologe Expression des Proteins von ORF800 und Assemblierung 101
6.1.9.1 Klonierung, heterologe Expression und Reinigung 101
6.1.9.2 Assemblierung von rekombinantem ORF800-Protein 102
6.1.9.3 Immunmarkierung mit ORF800-spezifischem Antikörper 103
6.2 Diskussion 103
IV. Abschließende Bemerkungen 107
V.Zusammenfassung 111
VI. Literaturverzeichnis 113
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis l
Inhaltsverzeichnis
I.Einleitung 1
II. Material und Methoden 11
1. Bezugsquellen von verwendeten Substanzen 11
1.1 Chemikalien 11
1.2 Enzyme, Plasmide und Reaktionskits 12
1.3PCR-Primer 12
1.5 Größenstandards 13
1.6 Geräte 13
1.7 Glasgeräte 14
1.8 Verbrauchsmaterialien 14
1.9 Verwendete Organismen und Viren 14
1.10 Herkunft der Originalproben 15
2. Allgemein verwendete Puffer und Lösungen 15
3. Medien, Zusätze und Sterilisation 17
3.1 LB-Medium (Eschehchia co//-Medium, Miller, 1972) 17
3.2 Alien-Medium YF (für kontinuierlichen Chemostat, Eis, 1999) 18
3.3 Sulfolobales-Medium (nach Allen etai, 1959; Brock etal., 1972; modifiziert) 19
3.5 Gelriteplatten für Einzelkolonien von Acidianus 20
3.6 Gelriteplatten für Hemmtests 20
3.7 Sterilisation 20
4. Kultivierung der verwendeten Organismen 20
4.1 Eschehchia coli 20
4.2 Pyrobaculum 20
4.3 Chemostat 21
4.4 Aerobe Anzucht der Sulfolobales 21
4.5 Anaerobe Anzucht von Acidianus 21
4.6 Kultivierung im Großmalistab 21
4.7 Mikroskopie und Lebend-Tot-Färbung 22
4.8 Gesamt-Zellzahl 22
4.9 Konservierung 22
5. Isolierung von S-Layer, Membranen und Zellanhängen 22
5.1 S-Layer-Isolierung und Membranisolierung 22
5.2 Isolierung von Zellanhängen 23
6. Manipulation an Viren 23
6.1 Virus-Isolierung 23
6.1.1 CsCI-Gradient 23
6.1.2 Ultrafiltration 23
6.2 Viruspräparation aus Zellkulturen 23
6.3 Virus-Infektion 24
6.4 Tropftest 24
6.5 Plaquetest 24
6.6 Quantifizierung von Viruspartikeln 25
6.7 Dialyse 25
7. Elektronenmikroskopie 25
7.1 Vorbereitung der Proben 25
7.1.1 Negativkontrastierung 25
7.1.2 Bedampfung mit Platin 25
7.1.3 Gefrierätzung 26
7.2 Elektronenmikroskopische Betrachtung der Präparate 26
7.3 Dreidimensionale Rekonstruktion der Viren durch Elektronentomographie 26
8. Manipulation an Nukleinsäure 27
Inhaltsverzeichnis M
8.1 Herstellung von gebrauchsfertigem Aqua Phenol 27
8.2 Konzentrationsbestimmung 27
8.3 Isolierung von DNA aus Zellen bzw. von Gesamt-DNA aus infizierten Zellen 27
8.4 Virus-DNA-Präparation 27
8.5 Isolierung von viraler ccc-DNA nach alkalischer Lyse (Birnboim und Doly, 1979;
Sambrook etal., 1989; modifiziert) 28
8.6 Restriktionsendonukleasenverdau 28
8.7 Polymerase-Ketten-Reaktion 28
8.8 Gelelektrophorese 29
8.9 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen 29
8.10 Ligation, Klonierung und Plasmidpräparation 30
8.10.1 Herstellung kompetenter Zellen 30
8.10.2 Ligation 30
8.10.3 Transformation von E coli 30
8.10.4 Plasmidpräparation 31
8.11 Sequenzierung von PCR-Produkten, Plasmid-DNA und Virus-Genomen 31
8.12 Sequenzdaten-Auswertung 31
8.13Southern-Hybridisierung 32
9. Proteinchemische Methoden 33
9.1 Konzentrationsbestimmung 33
9.2 Virus-Gesamt-Protein und Zeil-Protein 33
9.3 SDS-PAGE nach Laemmli (1970) 33
9.4 Färbung der Proteinbanden 33
9.4.1 Coomassie*-Färbung 33
9.4.2 Silber-Färbung (Blum etal., 1987) 34
9.4.3 Periodat-Schiff-Färbung (PAS-Färbung) (Segrest und Jackson, 1972) 34
9.5 Protein-Sequenzierung und -Detektion 34
9.5.1 Transfer von Protein auf PVDF-Membranen 34
9.5.2 N-terminale Sequenzierung 34
9.5.3 Immunologischer Nachweis des His-Tag 35
9.5.4 Immunologischer Nachweis mit spezifischen Antikörpern 35
9.6 Expression von rekombinantem Protein in £. coli 36
9.7 Reinigung von rekombinanten Protein mit His-Tag 36
9.8 Reinigung über Hitzeschritt und Superdex200 37
9.9 Assemblierung von gereinigtem ARV1-Hüll-Protein 37
9.10 Assemblierung von gereinigtem ATV-ORF800-Protein 37
10. Lipidanalyse 37
III. Ergebnisse und Diskussion 38
A. Untersuchung einer geothermal erhitzten Quelle aus dem
Yellowstone National Park/USA 38
1. Diversität der VLPs und Mikroorganismen in einer Quelle aus dem Yellowstone
National Park/USA 38
1.1 Ergebnisse 38
1.1.1 Diversität von VLPs im kontinuierlichen Chemostat 38
1.1.2 Diversität der Mikroorganismen im kontinuierlichen Chemostat 40
1.2 Diskussion 41
2. Pyrobaculum spherical Virus, PSV (eine neue Virus-Familie; die „Globuloviridae").43
2.1 Ergebnisse 43
2.1.1 Infektionsversuche 43
2.1.2 Morphologie von PSV 44
2.1.3 Proteine und Upidevon PSV 46
2.1.4 Virus-Wirt-Beziehung 48
2.1.5 Genom von PSV 49
2.2 Diskussion 50
Inhaltsverzeichnis J!i
B. Untersuchung einer geothermal erhitzten Quelle aus Pozzuoli/
Italien 52
1. Diversität der Viren in einer Quelle aus Pozzuoli/Italien 52
1.1 Ergebnisse 52
1.1.1 Diversität der VLPs in den Anreicherungen 52
1.1.2 Diversität der Mikroorganismen in den Anreicherungen 53
1.1.3 VLP produzierende Stämme 54
1.1.4 Infektiösität der VLPs, Virus-Wirte 54
1.2 Diskussion 55
2. Acidianus rod-shaped Virus, ARV1 (Virus-Familie Rudiviridae) 57
2.1 Ergebnisse 57
2.1.1 Reinigung von ARV1 57
2.1.2 Wirte 57
2.1.3 Struktur von ARV1 57
2.1.4 Virus-Wirt-Interaktionen 60
2.1.5 Proteine von ARV1 61
2.1.6 Das Genom von ARV1 62
2.1.7 Heterologe Expression und Assemblierung des ARV1-Hüll-Proteins 64
2.1.7.1 Klonierung, heterologe Expression und Reinigung 64
2.1.7.2 Immunmarkierung mit ARV1-Hüll-Protein-spezifischem Antikörper 65
2.1.7.3 Assemblierung des rekombinanten ARV1-Hüll-Proteins 66
2.2 Diskussion 66
3. Acidianus filamentous Virus 2, AFV2 (Virus-Familie Lipothrixviridae) 70
3.1 Ergebnisse 70
3.1.1 Reinigung von AFV2 und Wirts-Spektrum 70
3.1.2 Struktur von AFV2 70
3.1.3 Proteine und Lipide von AFV2 72
3.1.4 Persistenz von AFV2 72
3.1.5 Das Genom von AFV2 73
3.2 Diskussion 74
4. Acidianus filamentous Virus 3, AFV3 (Virus-Familie Lipothrixviridae) 76
4.1 Ergebnisse 76
4.1.1 Reinigung von AFV3 und Wirts-Spektrum 76
4.1.2 Struktur von AFV3 76
4.1.3 Proteine und Lipide von AFV3 79
4.1.4 Das Genom von AFV3 79
4.2 Diskussion 81
5. Acidianus bottle-shaped Virus, ABV (neue Virus-Familie: jUmpullaviridae") 82
5.1 Ergebnisse 82
5.1.1 Reinigung von ABV 82
5.1.2 Wirts-Spektrum von ABV 82
5.1.3 Virus-Wirt-Interaktionen 83
5.1.4 Struktur von ABV 83
5.1.5 Proteine von ABV 88
5.1.6 Genom von ABV 88
5.2 Diskussion 88
6. Acidianus two-tailed Virus, ATV (neue Virus-Familie: „Bicaudaviridae") 90
6.1 Ergebnisse 90
6.1.1 Reinigung von ATV 90
6.1.2 Wirts-Spektrum und extrazelluläre Entwicklung von ATV 90
6.1.3 Einfluss von ATV auf das Wachstum von A convivator" 91
6.1.4 Struktur von ATV 92
6.1.5 Infektiösität beider Virus-Formen 96
6.1.6 Proteine und Lipide von ATV 97
6.1.7 Genom von ATV 99
Inhaltsverzeichnis [V
6.1.8 Integration von ATV ins Wirts-Genom von JK. convivatoi" 100
6.1.9 Heterologe Expression des Proteins von ORF800 und Assemblierung 101
6.1.9.1 Klonierung, heterologe Expression und Reinigung 101
6.1.9.2 Assemblierung von rekombinantem ORF800-Protein 102
6.1.9.3 Immunmarkierung mit ORF800-spezifischem Antikörper 103
6.2 Diskussion 103
IV. Abschließende Bemerkungen 107
V.Zusammenfassung 111
VI. Literaturverzeichnis 113 |
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