Effekt eines adenoviralen Vektors auf die Produktion angiogeneseregulierender Faktoren in Zelllinien des nichtkleinzelligen Bronchialkarzinoms:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Lungenkarzinom 6
1.2 Angiogenese 8
1.2.1 Tumorangiogenese 9
1.2.2 VEGF 10
1.2.3 bFGF 11
1.2.4 Angiostatin 11
1.3 Gentherapie 12
1.3.1 Adenoviren 13
1.3.1.1 Aufbau des Adenovirus 14
1.3.1.2 Virales Genom 14
1.3.1.3 Transkription und Replikation 15
1.3.1.4 Biologie des Eintritts des Adenovirus in die Zelle 16
1.3.1.5 Adenovirale Vektoren der ersten Generation 16
1.3.1.6 Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 17
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Zelllinien 18
2.1.2 Zellkulturmedien 18
2.1.3 Chemikalien und Reagenzien 19
2.1.4 Reagenziensätze 20
2.1.5 Lösungen und Puffer 21
2.1.6 Antikörper 22
2.1.7 Geräte 22
2.1.8 Computer-Software 24
2.2 Methoden
2.2.1 Zellkultur
2.2.1.1 Kultivierung der Zellen 25
2.2.1.2 Auftauen und Einfrieren der Zellen 25
2.2.1.3 Passagieren der Zellen 26
2.2.1.4 Gewinnung der Zellen für Versuchszwecke 26
2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 26
2.2.1.6 Endothelzellmigrationsassay 27
2.2.1.7 MTT-Endothelzellproliferationsassay 27
2.2.2 Viraler Vektor
2.2.2.1 Ad.RSV.lacZ 28
2.2.2.2 Infektion mit Ad.RSV.lacZ 29
2.2.2.3 X-Gal-Färbung 29
2.2.3 RT-PCR
2.2.3.1 Isolierung von RNA aus den Tumorzellen 30
2.2.3.2 Bestimmung der RNA-Menge 31
2.2.3.3 DNA-Verdauung 32
2.2.3.4 Reverse Transkription 32
2.2.3.5 Semiquantitative PCR 33
2.2.3.6 Agarosegelelektrophorese 35
2.2.4 Western Blot
2.2.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 35
2.2.4.2 Blotting 36
2.2.4.3 Färbung und Blocken 37
2.2.4.4 Immunodetektion 37
2.2.5 ELISA
2.2.5.1 VEGF-ELISA 38
2.2.5.2 basic FGF-ELISA 39
2.2.6 Angiostatin-Generierungsaktivität 40
2.2.7 Statistik 40
3 Ergebnisse
3.1 Effektivität der Infektion/Transfektion 41
3.2 Proliferation der Zellen 41
3.3 VEGF- und bFGF-Expression auf Genomebene 43
3.4 VEGF-Expression auf Proteinebene 44
3.5 bFGF-Expression auf Proteinebene 46
3.6 VEGF-Expression in der bFGF-negativen Zelllinie H358 49
3.7 Endothelzellproliferationsassay 50
3.8 VEGF-Expression in serumfreien Zellkulturüberständen 51
3.9 Endothelzellproliferationsassay mit serumfreien Zellkulturüberständen 52
3.10 Endothelzellmigrationsassay mit serumfreien Zellkulturüberständen 53
3.11 Angiostatin-Generierungsaktivität 54
4 Diskussion 56
5 Zusammenfassung 67
6 Literatur 69
7 Anhang
7.1 Stadieneinteilung des Bronchialkarzinoms
7.1.1 TNM-Klassifikation 87
7.1.2 Stadiengruppierung 88
8 Danksagung 89
9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 90
10 Lebenslauf mit wissenschaftlichem Werdegang 91
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Lungenkarzinom 6
1.2 Angiogenese 8
1.2.1 Tumorangiogenese 9
1.2.2 VEGF 10
1.2.3 bFGF 11
1.2.4 Angiostatin 11
1.3 Gentherapie 12
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1.3.1.2 Virales Genom 14
1.3.1.3 Transkription und Replikation 15
1.3.1.4 Biologie des Eintritts des Adenovirus in die Zelle 16
1.3.1.5 Adenovirale Vektoren der ersten Generation 16
1.3.1.6 Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 17
2 Material und Methoden
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2.1.2 Zellkulturmedien 18
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2.1.4 Reagenziensätze 20
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2.1.6 Antikörper 22
2.1.7 Geräte 22
2.1.8 Computer-Software 24
2.2 Methoden
2.2.1 Zellkultur
2.2.1.1 Kultivierung der Zellen 25
2.2.1.2 Auftauen und Einfrieren der Zellen 25
2.2.1.3 Passagieren der Zellen 26
2.2.1.4 Gewinnung der Zellen für Versuchszwecke 26
2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 26
2.2.1.6 Endothelzellmigrationsassay 27
2.2.1.7 MTT-Endothelzellproliferationsassay 27
2.2.2 Viraler Vektor
2.2.2.1 Ad.RSV.lacZ 28
2.2.2.2 Infektion mit Ad.RSV.lacZ 29
2.2.2.3 X-Gal-Färbung 29
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2.2.3.1 Isolierung von RNA aus den Tumorzellen 30
2.2.3.2 Bestimmung der RNA-Menge 31
2.2.3.3 DNA-Verdauung 32
2.2.3.4 Reverse Transkription 32
2.2.3.5 Semiquantitative PCR 33
2.2.3.6 Agarosegelelektrophorese 35
2.2.4 Western Blot
2.2.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 35
2.2.4.2 Blotting 36
2.2.4.3 Färbung und Blocken 37
2.2.4.4 Immunodetektion 37
2.2.5 ELISA
2.2.5.1 VEGF-ELISA 38
2.2.5.2 basic FGF-ELISA 39
2.2.6 Angiostatin-Generierungsaktivität 40
2.2.7 Statistik 40
3 Ergebnisse
3.1 Effektivität der Infektion/Transfektion 41
3.2 Proliferation der Zellen 41
3.3 VEGF- und bFGF-Expression auf Genomebene 43
3.4 VEGF-Expression auf Proteinebene 44
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3.6 VEGF-Expression in der bFGF-negativen Zelllinie H358 49
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3.9 Endothelzellproliferationsassay mit serumfreien Zellkulturüberständen 52
3.10 Endothelzellmigrationsassay mit serumfreien Zellkulturüberständen 53
3.11 Angiostatin-Generierungsaktivität 54
4 Diskussion 56
5 Zusammenfassung 67
6 Literatur 69
7 Anhang
7.1 Stadieneinteilung des Bronchialkarzinoms
7.1.1 TNM-Klassifikation 87
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