Immunoassays:
Gespeichert in:
| Format: | Buch |
|---|---|
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Elsevier, Spektrum Akad. Verl.
2007
|
| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | XXII, 370 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3827416361 9783827416360 |
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Datensatz im Suchindex
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einführung in Immunoassays............................. 1
1.1 Einleitung............................................. 1
1.2 Biologische Grundlagen der Immunoassays ................. 2
1.2.1 Grundlagen der Immunabwehr............................ 2
1.2.2 Die
1.2.3 Struktur und biologische Funktion der Antikörper........... 5
1.3 Antikörper in der Analytik............................... 8
1.3.1 Antikörper als Analysewerkzeug........................... 8
1.3.2 Erzeugung von Antikörpern für Immunoassays.............. 9
1.4 Immunoassays - die Qual der Wahl....................... 11
1.4.1 Auswahl eines geeigneten Immunoassays................... 11
1.4.2 Überblick über die gängigsten Immunoassays............... 13
2 Antikörper............................................ 19
2.1 Einleitung............................................ 19
2.2 Struktur und Funktion.................................. 20
2.2.1 Enzymverdau.......................................... 22
2.2.2 Isotypen - Fc-Region................................... 24
2.2.3 Allotypen, Rheumafaktoren, Idiotypen,
2.2.4 Die hypervariable Region - CDR ........................ 28
2.2.5 Fc-Rezeptoren......................................... 29
2.3 Affinität, Avidität und KD-Wert.......................... 30
2.4 Immunisierung........................................ 32
2.4.1 Das
2.4.2 Wahl der Tierspezies und Art der Immunisierung........... 33
2.4.3 Austestung der Immunantwort........................... 35
2.5 Monoklonale Antikörper................................ 35
2.5.1 Hinweise............................................. 37
2.6 Humane monoklonale Antikörper, rekombinante, gentechnisch
hergestellte Antikörper und Varianten..................... 38
XVI Inhaltsverzeichnis
2.7 Produktion ........................................... 40
2.8 Aufreinigung/Extraktion ................................ 43
2.9 Konjugation........................................... 47
2.10 Ende gut, alles gut ..................................... 49
3 Labormethoden ....................................... 51
3.1 ELISA/EIA/FIA........................................ 51
3.1.1 Historisches........................................... 51
3.1.2
3.1.2.1 Direkte und indirekte
3.1.2.2 Kompetitive und nichtkompetitive
3.1.3 Bindung an die Oberfläche.............................. 54
3.1.4 Kopplung des Markerenzyms/Signalverstärkung............. 56
3.1.5 Einsatz von Antikörperfragmenten........................ 57
3.1.6 Etablierung und Durchführung von ELISAs................ 57
3.1.6.1 Beschichtung der ELISA-Platte........................... 59
3.1.6.2 Blockierung von Oberflächen............................ 60
3.1.6.3 Inkubation mit Sekundär-Antikörper...................... 61
3.1.6.4 Detektion über die Farbreaktion.......................... 62
3.1.6.5 Bestimmung der Funktionalität des Fängerantikörpers....... 62
3.1.6.6 Inkubation mit Detektorantikörper....................... 63
3.1.6.7 Quantifizierung........................................ 65
3.1.7 Fluoreszenzimmunoassay................................ 66
3.1.8 Rezepte............................................... 67
3.1.8.1 Musterprotokoll (Sandwich-ELISA)....................... 67
3.1.8.2 Biotinylierung von Antikörpern.......................... 68
3.2 Immuno-PCR: Hochsensitive Protein-Analytik mit Antikörper-
DNA-Konjugaten...................................... 70
3.2.1. Die Methode der Immuno-PCR.......................... 70
3.2.1.1 Die Verknüpfung von Antikörpern und DNA............... 72
3.2.1.2 Der Nachweis des IPCR-Produktes........................ 73
3.2.1.3 Die Optimierung der IPCR.............................. 73
3.2.2 Musterprotokoll eines Imperacer^-Nachweises für
3.2.3 Einsatzgebiete der Immuno-PCR......................... 78
3.3 Die Detektion von Proteinen auf Membranen: Dot-Blot- und
Western-Blot- Verfahren................................. 81
3.3.1 Das Western-Blot-Verfahren............................. 81
3.3.1.1 Proteintrennung durch Gelelektrophorese.................. 81
3.3.1.2 Transfer der Proteinmuster auf eine Membran.............. 84
3.3.2 Das Dot-Blot-Verfahren................................. 85
3.3.3 Die Proteindetektion ................................... 85
3.3.4 Dot-Blot-Verfahren versus Western-Blot-Technik............ 88
Inhaltsverzeichnis XVII
3.3.5 Kurzes Ablaufschema des Western-Blot-Verfahrens .......... 89
3.3.6 Hinweise und Tipps.................................... 90
3.4
3.4.1 Einführung........................................... 92
3.4.2 Anwendungen von
3.4.2.1 Analytische
3.4.2.2 Funktionale Protein-Chips............................... 95
3.4.2.3 Anforderungsprofile an
3.4.3 Technologie........................................... 98
3.4.3.1 Chipaufbau........................................... 98
3.4.3.2 Herstellung........................................... 100
3.4.3.2.1 Die Proteine.......................................... 101
3.4.3.2.2
3.4.3.2.3 Die Trägeroberfläche ................................... 101
3.4.3.2.4 Die Detektion......................................... 102
3.4.4 Ausblick.............................................. 105
3.4.4.1 Was bringt die Zukunft? ................................ 105
3.4.4.2 Ein Beispiel: Die IMPACT-Technologie.................... 106
3.5 Oberflächenplasmonen-Resonanz......................... 110
3.5.1 Grundlagen der SPR.................................... 110
3.5.1.1 Registrierung der SPR.................................. 118
3.5.1.2 Verschiebung der SPR durch eine aufliegende Schicht........ 118
3.5.1.3 Auswahl der Prismen .................................. 120
3.5.2 SPR-Imaging.......................................... 121
3.5.2.1 Anwendungen......................................... 124
3.5.2.2 Ausblicke ............................................ 124
3.6 Zytometrie............................................ 127
3.6.1 Einfuhrung........................................... 127
3.6.1.1 Durchflusszytometrie................................... 130
3.6.1.2 Objektträgerbasierte Zytometrie.......................... 131
3.6.1.3 Die Bestimmung der Expression von Leukocytenaktivierungs-
markern durch FCM ................................... 133
3.6.1.4 Quantifizierung von Endothelvorläuferzellen mithilfe
der SBC.............................................. 134
3.6.2 Beschreibung der Methoden und Anwendung in der Praxis ... 136
3.6.2.1 Standardisierung und Kalibrierung........................ 136
3.6.2.2 Titration von Antikörpern und Farbstoffen................. 138
3.6.2.3 Negativkontrolle....................................... 138
3.6.2.4 Beispiel: Kalibrierung................................... 139
3.6.3 FCM-Analyse und Leukocytenaktivierungsmarker........... 140
3.6.3.1 Entnahme und Aufbereitung von Blutproben............... 140
3.6.3.2 Monoklonale Antikörper (mab).......................... 140
3.6.3.3 Messung durch FCM................................... 141
XVIII Inhaltsverzeichnis
3.6.3.4 Analyse und Darstellung der Daten von FCM-Messungen----- 141
3.6.3.5 Beispiel: FCM-Analyse der Antigenexpression............... 142
3.6.4 LSC-Analyse von EPCs.................................. 143
3.6.4.1 Entnahme von Blutproben .............................. 143
3.6.4.2 Kurzzeitzellkulturen und Färbung ........................ 144
3.6.4.3 Analyse von EPC-Proben................................ 144
3.6.4.4 Analyse der EPC-Daten................................. 146
3.6.4.5 Beispiel: LSC-Analyse von EPCs.......................... 147
3.6.5 Fehlersuche........................................... 148
3.6.5.1 FCM................................................. 148
3.6.5.2 LSC.................................................. 150
3.6.6 Danksagung........................................... 151
3.7 Immunhistochemie für Forschung und
diagnostische Pathologie................................ 155
3.7.1 Fixierung............................................. 155
3.7.2 Antigendemaskierungstechniken ......................... 157
3.7.3 Signalamplifikation .................................... 158
3.7.4 Multiple Immunfluoreszenzmarkierung.................... 160
3.7.4.1 Protokolle für multiple Immunfärbungen durch Gebrauch
monoklonaler Primär-Antikörper von verschiedenen
Ig-Isotypen........................................... 165
3.7.5 Multiple Immunenzymmarkierung ....................... 166
3.7.5.1 Protokoll für die gleichzeitige Immunenzymdoppelfärbung
unter Benutzung von Primär-Antikörpern, die in zwei
verschiedenen Spezies hergestellt wurden .................. 167
3.7.5.2 Protokoll für die sequenzielle Immunenzymdoppelfärbung ... 169
3.7.6 Automatisierung in der Immunhistochemie................ 170
3.8 Immunochemilumineszenzverfahren: Anwendung für die
semiquantitative Genexpressionsanalyse des gesamten
menschlichen Genoms.................................. 178
3.8.1 Die Aufklärung des genetischen Codes und neue Ansätze zur
Untersuchung polygener Krankheiten..................... 178
3.8.2 Prinzip der Methode ................................... 179
3.8.2.1 Mikroarraybasierte Genexpressionsanalyse................. 179
3.8.2.2 Probennahme und Probenvorbereitung ................... 179
3.8.2.3 Hybridisierung und Detektion ........................... 180
3.8.2.4 Vergleichende Datenauswertung und Bestimmung
differenziell regulierter Gene............................. 183
3.8.3 Anwendungen in der Medizin............................ 185
3.8.3.1 Tumorbiologische Taxonomien........................... 185
3.9 Fluoreszenzmikroskopie in der Immunoassayanwendung -
eine Einführung....................................... 187
3.9.1 Was ist Fluoreszenz?.................................... 187
Inhaltsverzeichnis XIX
3.9.2 Prinzip und Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops........... 189
3.9.3 Strahlengang eines Epifluoreszenzmikroskops............... 193
3.9.4 Anwendungen für die Fluoreszenzmikroskopie.............. 194
3.9.5 Grenzen der Fluoreszenzmikroskopie...................... 194
4 Fluoreszenzfarbstoffe................................... 197
4.1 Einführung........................................... 197
4.1.1 Kleine Farbenlehre..................................... 199
4.2 Charakterisierung von Fluoreszenzfarbstoffen............... 201
4.3 Instrumentelle Voraussetzungen.......................... 202
4.4 Praktischer Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen.............. 205
4.5 Herstellung von Antikörper-Fluorophor-Konjugaten......... 207
4.5.1 Kopplung an Aminogruppen der Antikörper ............... 208
4.5.2 Kopplung an Kohlenhydratreste.......................... 211
4.5.3 Kopplung an
5 Oberflächen........................................... 215
5.1 Immobilisierung....................................... 215
5.1.1 Prinzipien der passiven Adsorption an Polystyrol............ 215
5.1.1.1 Adsorptionskräfte...................................... 215
5.1.1.2 Adsorbierende Oberflächen.............................. 217
5.1.2 Die Wahl der richtigen Oberfläche........................ 226
5.1.3 Oberflächen für kovalente Bindung....................... 227
5.1.4 Immobilisierung von DNA.............................. 232
5.1.4.1 Festphasen-DNA-ASSAYS ............................... 232
5.1.4.2 Festphasen-PCR....................................... 233
5.1.4.3 PCR-ELISA........................................... 234
5.2 Biochips und Mikrofluidik aus Kunststoffen: Neue Plattformen
für diagnostische Anwendungen.......................... 235
5.2.1 Kunststoffoberflächen für Biochips........................ 236
5.2.2 Anwendungen in der Praxis ............................. 237
5.2.3 Kunststoffe für die Mikrofluidik.......................... 238
5.2.4 Fertigungsverfahren für mikrostrukturierte Komponenten .... 239
5.2.5 Werkstoffe und Formate mikrofluidischer Strukturen........ 240
5.2.5.1 Anwendungsbeispiel ................................... 240
6 Störeffekte bei Immunoassays............................ 243
6.1 Störungen durch Immunoassay-Label..................... 244
6.2 Störungen durch die verwendeten Assay-Antikörper......... 246
6.3 Störungen durch Matrixeffekte........................... 247
XX
6.3.1 Störungen durch Chemikalien und Puffer.................. 247
6.3.2 Störungen durch humane Antikörper, gerichtet gegen
Immunglobuline tierischen Ursprungs..................... 248
6.3.3 Störungen durch heterophiie Antikörper................... 250
6.3.4 Störungen durch Proteine und endogene Bestandteile
der Probe............................................. 250
6.4 Störungen durch Kreuzreaktionen und unspezifische
Bindungen............................................ 252
6.5 Der Hook-Effekt....................................... 253
6.6 Vermeidung von Störeffekten............................ 254
7
Durchführung von ELISAs .............................. 257
7.1 Einführung........................................... 257
7.2 Durchführung von ELISAs .............................. 260
7.3 ELISA-Entwicklung und -Optimierung.................... 260
7.3.1 Testsensitivität......................................... 261
7.3.2 Überprüfung der Reagenzien............................. 261
7.3.3 Bedeutung der Haptenkopplung.......................... 266
7.3.4 Der Einfluss von Puffersystemen.......................... 268
7.3.5 BeSchichtung der Mikrotiterplatte ........................ 270
7.3.6 Verwendung selbst gewonnener Antikörper................. 272
7.3.7 Probenvorbereitung.................................... 272
7.4 Zusammenfassung..................................... 273
8 Auswertung und Validierung............................. 275
8.1 Ausreißertests......................................... 275
8.1.1 Der Henning-Test...................................... 276
8.2 Validierung von Immunoassays........................... 277
8.2.1 Validierungsparameter.................................. 280
8.2.1.1 Richtigkeit oder
8.2.1.2 Präzision oder
8.2.1.3 Spezifität oder
8.2.1.4 Nachweisgrenze oder
of detection
8.2.1.5 Bestimmungsgrenze oder quantitation
of
8.2.1.6 Linearität oder
8.2.1.7 Messbereich oder
8.2.1.8 Robustheit oder
Inhaltsverzeichnis XXI
8.2.1.9 Sensitivität............................................ 285
8.2.2 Die fünf Platten zum Erfolg............................. 286
8.2.3 Störeruntersuchung für Fortgeschrittene................... 288
9 Regulatorische Anforderungen an die Entwicklung von
In vitro-Diagnostika ................................... 293
9.1 Einleitung............................................ 293
9.2 Definitionen.......................................... 294
9.2.1 In vitro-Diagnostika ................................... 294
9.2.2 Bevollmächtigter des Herstellers.......................... 295
9.2.3 Sicherheitsbeauftragter für Medizinprodukte ............... 296
9.2.4 Medizinprodukteberater................................. 296
9.3 Harmonisierte Normen................................. 296
9.4
untersuchungen ....................................... 297
9.4.1 Akkreditierung von Laboratorien......................... 300
9.5
9.6
9.7 Allgemeine Anzeigepflicht des IVD-Herstellers.............. 303
9.8 Leistungsbewertungsprüfungen von In vitro-Diagnostika..... 304
9.8.1 Leistungsbewertungsprüfungen anhand geeigneter Daten..... 304
9.8.2 Leistungsbewertungsprüfungen anhand klinischer
Prüfungen............................................ 305
9.8.3 Klinische Prüfung von In vitro-Diagnostika................ 306
9.8.3.1 PrüferbroschüreZ-information - Handbuch des klinischen
Prüfers............................................... 307
9.8.3.2 Nutzen-Risiko-Bewertung von Medizinprodukten........... 309
9.8.3.3 Prüfplan zur klinischen Prüfung eines
IVD-Medizinproduktes................................. 309
9.8.3.4 Beschriftung/Kennzeichnung von IVDs zur
Leistungsbewertung.................................... 309
9.8.3.5 Prüfleiter und Prüfer................................... 310
9.8.3.6 Probandenversicherung................................. 310
9.8.3.7 Patienteninformation und Patienteneinwilligungserklärung ... 311
9.8.3.8 Registrierte Ethikkommission und Votum der
Ethikkommission...................................... 312
9.8.3.9 Online-Erfassungssysteme für Anzeigeverfahren von Medizin¬
produkten ............................................ 314
9.8.3.10 Monitoring während klinischer Prüfungen................. 314
9.8.3.11 Meldeverpflichtung von Schäden......................... 315
XXII Inhaltsverzeichnis
9.8.3.12 Zeitplan für die Meldung von Vorkommnissen und Beinahe-
Vorkommnissen sowie zuständige Behörden................ 316
9.8.3.13 Überwachung der klinischen Prüfung..................... 317
9.8.3.14 Abschluss und Archivierung von Medizinprodukt-Studien
im Device Master File .................................. 317
9.8.4 Voraussetzungen klinischer VD-Prüfungen in den USA....... 320
9.9 Benannte Stellen....................................... 322
9.9.1 Zuständige Behörden der Benannten Stellen -
ZLG und ZLS......................................... 322
9.10 Konformitätsbewertungsverfahren........................ 323
9.10.1 Grundlegende Anforderungen............................ 326
9.11
9.12 Qualitätsmanagementsystem - QMS...................... 327
9.12.1 Qualitätshandbuch..................................... 328
9.12.2 Standard
9.13 Überwachung von IVD-Herstellern....................... 332
9.13.1 Zuständige Bundesoberbehörden......................... 332
9.13.2 Zuständige Behörden in Deutschland...................... 333
9.13.3 Zuständige Behörden in den EWR-Mitgliedsstaaten.......... 333
10 Marktorientiertes Innovationsmanagement................. 337
10.1 Einleitung............................................ 337
10.2 Innovation - Begriff und Erfolgsfaktoren.................. 338
10.3 Forscher und Manager - die Unvereinbarkeit
zweier Welten?......................................... 340
10.4 Geschäftsplan als Bindeglied zwischen Forschung und
Kommerzialisierung.................................... 342
10.4.1 Analyse des Zielmarktes................................. 343
10.4.1.1 Informationsgewinnung................................. 344
10.4.1.2 Marktentwicklung und Marktprognose.................... 345
10.4.1.3 Wettbewerbsanalyse.................................... 345
10.4.1.4 SWOT-Analyse........................................ 348
10.4.2 Ziele und Strategie..................................... 349
10.4.2.1 Wettbewerbsstrategie................................... 350
10.4.2.2 Geschäftsfeldstrategie................................... 352
10.4.2.3 Marktsegmentierung und Marktbearbeitungsstrategie........ 354
10.4.3 Patente und Schutzrechte................................ 356
10.5 Zusammenfassung und Fazit............................. 357
Glossar....................................................... 361
Index......................................................... 365
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