In vitro-Interaktion der E3-Ubiquitin-Ligase HectH7 mit dem potentiellen Tumorsuppressor CDX2 und Herstellung aufgereinigter polyklonaler Antikörper gegen HectH7:
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Berlin
Logos-Verl.
2005
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis 7
Abkürzungen 11
1. Einleitung 15
1.1. Kolorektales Karzinom 15
1.1.1. Epidemiologie 15
1.1.2. Genetischer Hintergrund 15
1.1.3. Hereditäre Tumorsyndrome 16
1.1.3.1. FAP als Modell für die Tumorinitiierung 16
1.1.3.2. HNPCC als Modell für die Tumorprogression 17
1.1.4. Sporadische Tumoren 18
1.2. CDX2, ein potentielles Tumorsuppressorgen? 19
1.2.1. Die CDX Familie 20
1.2.2. CDX2 im adulten Darm 21
1.2.3. CDX2 und kolorektale Karzinogenese 22
1.3. Der Ubiquitin Proteasom Signalweg 22
1.3.1. Ablauf der Ubiquitinierungskaskade 23
1.3.2. Bestandteile des Ubiquitin Proteasom Signalwegs 24
1.3.2.1. Ubiquitin 25
1.3.2.2. El oder UBA 25
1.3.2.3. E2 oder UBC 26
1.3.2.4. E3 oder Ubiquitin Protein Ligasen 26
1.3.2.5. Das Proteasom 26
1.3.3. Die Hect Familie der E3 Ligasen 27
1.3.3.1. Nedd4 ähnliche HECT E3 Ligasen 27
1.4. HectH7 28
1.4.1. Die WW Domänen 29
1.5. Zielsetzung dieser Arbeit 30
2. Material und Methoden 31
2.1. Bakterielle Systeme 31
2.1.1. Präparation chemisch kompetenter Bakterien 31
2.1.2. Vorbereitung von Bakterien für Elektroporation 31
2.1.3. Transformation chemisch kompetenter Bakterien 32
7
Inhaltsverzeichnis 2.1.4. Elektroporation 32
2.1.5. Anlegen von Dauerkulturen von Bakterien 33
2.2. Molekularbiologische Arbeiten 33
2.2.1. Präparation von DNA aus Bakterien 33
2.2.1.1. DNA Minipräparation 33
2.2.1.2. DNA Midipräparation und Maxipräparation 34
2.2.2. DNA Präzipitation 34
2.2.3. Konzentrationsbestimmung und Reinheitsprüfung der Plasmid DNA 34
2.2.4. SDM Site Directed Mutagenesis 35
2.2.5. Restriktionsanalyse 35
2.2.6. Analytische und Präparative Agarose Gelelektrophorese 35
2.2.6.1. Gelextraktion und Reinigung von DNA Fragmenten 36
2.2.7. DNA Ligation 36
2.2.8. DNA Sequenzierung 37
2.2.9. PCR 37
2.3. Proteinbiochemische Arbeiten 39
2.3.1./« viTro Transkription/Translation 39
2.3.2. Bakterielle Expression von GST Fusionsproteinen 39
2.3.2.1. Affinitätsreinigung von GST Fusionsproteinen 40
2.3.3. Bakterielle Expression von HIS Fusionsproteinen 40
2.3.3.1. Affinitätsreinigung von HIS Fusionsproteinen 41
2.3.4. Kopplung von HIS Fusionsproteinen an PIERCE Amino Link Säulen 41
2.3.5. Aufreinigung polyklonaler Antikörper aus Kaninchenserum 42
2.3.6. Bestimmung von Proteinkonzentrationen 43
2.3.7. SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gel Elektrophorese) 43
2.3.7.1. Coomassie Färbung 44
2.3.8. Fluorographie 44
2.3.9. GST Pulldown Assay 45
2.3.10. Western Blot 45
2.3.10.1. Ponceau Färbung 46
2.3.10.2. Immunfärbung 46
3. Ergebnisse 47
3.1.KlonierungderHectH7 Deletionskonstrukte 47
3.1.1. Herstellung von HectH7 AWW1 4 47
Inhaltsverzeichnis
3.1.2. Herstellung von HectH7 Konstrukten kombinierter WW Domänen mit bzw. ohne
N terminalem HectH7 49
3.1.3. Herstellung von HectH7 Konstrukten einzelner WW Domänen 50
3.1.4. Klonierung von GST CDX2 51
3.2. GST Pulldown Assays 51
3.2.1. Synthetisierung des GST CDX2 Fusionsproteins 51
3.2.2. In vjVro Transkription/Translation von HectH7 und HectH7 Konstrukten 52
3.2.3. Pulldown Assay mit HectH7 und GST CDX2 53
3.2.4. Pulldown Assay mit HectH7 AWW1 4 und GST CDX2 53
3.2.5. GST Pulldown Assays der 35S HectH7 Konstrukte 54
3.3. Testen von Tris Tricin Gelen in der SDS Page 56
3.3.1. Darstellung einzelner WW Domänen auf Tris Tricin Gelen 56
3.3.2. Biorad Fertig Gele im Vergleich 57
3.3.3. Pulldown Assay auf Tris Tricin Gelen 57
3.4. Generierung von GST HectH7 Konstrukten 58
3.4.1. Klonierung von 11 //ectf/7 Konstrukten in den Vektor pGEX2TK 58
3.4.2. Expression der 11 HectH7 Konstrukte in BL21 E. coli Bakterien 59
3.4.3. Binden der exprimierten HectH7 Konstrukte an Sepharose Beads 59
3.4.4. In viVro Transkription/Translation von CDX2 60
3.4.5. GST Pulldown Assays der GST HectH7 Konstrukte 61
3.5. Generierung von CDX2 AA37 Y A 63
3.5.1. GST Pulldown Assay mit CDX2 AA37 Y A und GST HectH7 63
3.6. Antikörper gegen HectH7 65
3.6.1. Herstellung polyklonaler Antikörper gegen HectH7 65
3.6.2. Aufreinigung von drei verschiedenen polyklonalen Antikörpern gegen HectH7.66
3.6.2.1. Klonierung von HIS HectH7 2 313, 2 156 und 154 313 66
3.6.2.2. Expression und Reinigung der HIS getaggten Proteine und Binden an
PIERCE Aminolink® Plus Immobilisation Kit 66
3.6.2.3. Western Blots mit gereinigten Antikörpern 68
3.6.3. Expression von HectH7 AA1 922 in einem in vi/ro Transkriptions Translations
System 69
3.6.3.1. Western Blot mit HectH7 AA1 922 69
3.6.4. Umtransformierung der 3 HIS Konstrukte in E. coli BL Codon Plus (DE3)RIL 70
9
Inhaltsverzeichnis 3.6.4.1. Herstellung von HIS HectH7 2 313 und 154 313 durch BL21 DE3 70
3.6.4.2. Western Blots mit allen HIS Proteinen 71
4. Diskussion 73
4.1. Methodik 73
4.1.1. /n vfe o Interaktionsstudien 73
4.1.2. Antikörper 74
4.2. Interaktion von HectH7 und CDX2 75
4.2.1. Bedeutung der einzelnen WW Domänen für die Interaktion 79
4.3. Ausblick 81
5. Zusammenfassung der Arbeit 83
6. Literaturverzeichnis 85
7. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 95
8. Lebenslauf 97
8.1. Veröffentlichungen: 98
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