Molekularbiologische Techniken bei der Diagnostik keratinophiler Pilze (Dermatophyten):
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2004 [erschienen] 2005
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Seite
L Einleitung 1
IL Diagnostik und Klassifizierung von Dennatophvten
1. Pilzspezifische Primer 7
2. Der ITS-Bereich der ribosomalen RNA 9
III. Material und Methoden
1. Material
1.1 Verwandte Pilz-DNA
1.1.1 Bestimmung pilzspezifischer Primer 13
1.1.2 Bestimmung der ITS-Sequenz 14
1.2 Reagenzien
1.2.1 Kultivierung der Pilze
16
1.2.2 DNA-Extraktion 17
1.2.3 Polymerase-Chain-Reaction 17
1.2.4 Agarose-Gel 18
1.2.5 Sequenzierung von genomischer DNA mit AmpliTaq 19
1.2.6 Strangtrennung mit der „Streptavidin-coated magnetic
bead seperation -Technik 19
1.2.7 Sequenzierung nach der „DyeDeoxy ™ Terminator -
Methode 20
1.2.8 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese 20
13 Geräte 21
1.4 Verbrauchsmaterial 22
2. Methoden
2.1 Kultivierung der Dennatophyten 23
2.2 DNA-Extraktion aus Pilzkulturen 23
2.3 DNA-Konzentrationsbestimmung mittels
Spektralphotometrie 25
2.4 Polymcrase Chain Reaction (PCR)
2.4.1 Prinzip 25
2.4.2 Vorsichtsmaßnahmen 25
2.4.3 Vorbereitung der Proben (PCR-Ansatz) 27
2.4.4 DNA-Amplifikation im PCR-Prozessor 28
2.5 Gelelektrophorese
2.5.1 Agarosegel 29
2.5.2 Probenvorbereitung 30
2.6 Die Sequenzierung genomischer DNA/RNA
2.6.1 PCR zur Amplifikation genomischer DNA/RNA 31
2.6.2 Strangtrennung mit der „Streptavidin-coated magnetic
bead seperation -Technik 31
2.6.3 Die Sequenzierung nach der „Taq-cycle DyeDeoxy ™
Terminator -Methode 34
2.6.3.1 Reaktionsansatz für die Dye Terminator Cycle-
Sequenzierung mit Ampli Taq FS 34
2.6.3.2 Thermocycler Protokoll 35
2.6.3.3 Probenaufbereitung (Centn Sep) 35
2.6.4 Die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese 35
IV. Ergebnisse
L Pilzspezifische Primer 37
2. Der ITS-Bereich der ribosomalen RNA 44
V. Diskussion 47
VI. Zusammenfassung 59
VII. Literatur 63
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