Differentielle Genexpression in hämatopoetischen Stammzellen:
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| Veröffentlicht: |
2005
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis: Seiten
1. Einleitung 9
1.1 Modell der hämatopoetischen Stammzelle 9
1.2 Anatomie und Physiologie der Hämatopoese 13
1.2.1 Ontogenese der hämatopoetischen Gewebe 13
1.2.2 Komponenten der Knochenmarkumgebung 14
1.3 Cytokine und die Kontrolle der Hämatopoese 17
1.3.1 Cytokine mit linienspezifischer Wirkung 18
1.3.2 Early Acting Cytokines 21
1.4 Ziel der Arbeit 23
2. Methoden und Materialien 26
2.1 Die Zellkultur 26
2.2 Medien und Lösungen 26
2.3 Isolation der CD34+ Zellen aus PBSC 27
2.4 Fluoreszenz aktivierter Zellsortierer (FACS) Analyse 29
Der isolierten CD34+ Zellen
2.5 Stimulation der CD34+ Zellen 29
2.6 Isolierung und Quantifizierung der RNA 29
2.7 Suppression Subtractive Hybridization (SSH) 31
der RNA Proben
2.8 Detektion der subtrahierten cDNA Fragmente 34
2.8.1 Klonierug der subtrahierten cDNA Fragmente 34
2.9 Nachweis differentieller Genexpression mittels 35
RT-PCR
2.9.1 Produktion von cDNA aus RNA mit Hilfe der 35
reversen Transkriptase-Reaktion (RT)
2.9.2 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 36
2.9.3 Densitometrische Analyse 39
2.9.4 Quantitative Real-time RT-PCR der RNA der 39
gefundenen Gene
2.10 Westem-Blot des Osteopontin Proteins 43
2.11 Immunenzymatische Färbung von CD34+Zellen 45
2.12 Statistik 45
2.13 Materialien 46
3. Ergebnisse 51
3.1 FACS Analyse der CD34+selektionierten Zellen 51
3.2 Ergebnisse der SSH 53
3.3 Überprüfung differentieller Genexpression 58
ausgesuchter Gene mittels RT-PCR
3.4 Einfluss der Cytokinstimulation auf Osteopontin 67
3.4.1 Real time PCR von Osteopontin 67
3.4.2 Osteopontin Western-Blot 69
3.4.3 Osteopontin APAAP-Färbung 71
4. Diskussion 73
4.1 Charakterisierung und mögliche Funktionen von 77
NUMB und Hypothetical Protein MGC 33867 im
hämatopoetischen System
4.2 Charakterisierung und mögliche Funktionen von 78
Osteopontin im hämatopoetischen System
4.3 Nutzen und Wert einer Suppression Subtraktive 82
Hybridization (SSH)
5. Zusammenfassung 84
Literaturverzeichnis 85
Danksagung 103
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