Molekulare Pathomechanismen der GLRA(S231R)-Mutante des inhibitorischen Glycinrezeptors im rekombinanten Zellsystem:
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adam_text | Titel: Molekulare Pathomechanismen der GLRA(S231R)-Mutante des inhibitorischen Glycinrezeptors im rekombina
Autor: Kößler, Angela
Jahr: 2004
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung 1
1.1 Hintergrund und Ziele 1
1.2 Methoden 1
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen 1
1.4 Praktische Schlussfolgerungen 2
2 Einleitung 3
2.1 Das Neuron und die Signaltransduktion an der chemischen Synapse.. 3
2.2 Der inhibitorische Glycinrezeptor - Aufbau und Funktion 5
2.3 Erbliche Bewegungsstörungen durch Mutationen in GlyR-Genen 8
2.4 Die Glycinrezeptor-Mutation GlyRoc1s231R 9
2.5 Fragestellung und Zielsetzung 12
3 Ergebnisse 13
3.1 Die Mutation GlyRoc1S231R - Charakterisierung auf Proteinebene 13
3.1.1 Identifizierung von GlyRod^- und GlyRa1S231R-Protein in
HEK293-Zellen 13
3.1.2 Quantitative Analyse der Expression von GlyRai 1 und
GlyRa1S231R in HEK293-Zellen 15
3.1.3 Immunzytochemische Analyse der subzellulären Verteilung
von GlyRai*1 und GlyRa1S231R.. 17
3.1.4 Änderung des Rezeptorgehaltes in Gegenwart von
Lactacystin 19
3.1.5 3H-Strychnin-I_igandenbindungstests in An- und
Abwesenheit von Lactacystin 20
3.1.5.1 Spezifische Bindung von GlyRai*1 21
3.1.5.2 Spezifische Bindung von GlyRa1S231R 23
3.2 Subzelluläre Verteilung von GlyRai 26
3.2.1 Differentielle Zentrifugation nach Rickwood 26
3.2.2 Fraktionierung im linearen Sucrosegradienten 29
3.2.3 Weitere Gradienten 33
3.2.3.1 Diskontinuierlicher Sucrosegradient 33
3.2.3.2 Percollgradient 35
4 Diskussion 36
4.1 Methoden zur Beurteilung des Proteingehaltes von
Zellkompartimenten 36
4.2 Proteingehalt und Verteilungsmuster der a1-Untereinheit von
GlyRai*1 und GlyRa1S231R im rekombinanten Zellsystem 38
4.3 Verstärkter Proteinabbau als Erklärungsmodell der Pathobiochemie
derGlyRa1S231R-Mutante 41
4.4 Ausblick 46
5 Material und Methoden 48
5.1 Chemikalien, Verbrauchsmaterial und Geräte 48
5.2 Zellbiologische Methoden 50
5.2.1 Rekombinante Expression von Proteinen in HEK293-Zellen.. 50
5.2.2 Inkubation transfizierter HEK293-Zellen mit Lactacystin 51
5.2.3 Beschichtung und Transfektion von Deckgläschen 52
5.2.4 Fixierung von Zellen 53
5.2.5 Immunzytochemie 53
5.3 Proteinbiochemische Methoden 54
5.3.1 Isolierung von Membranfraktionen 54
5.3.2 Herstellung eines Zell-Lysats 55
5.3.3 Methoden zur Proteinbestimmung 56
5.3.3.1 Proteinbestimmung nach Lowry 56
5.3.3.2 Proteinbestimmung nach Bradford 56
5.3.3.3 Proteinbestimmung von Percoll enthaltenden
Proben 57
5.3.4 TCA-Fällung von Proteinen 57
5.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 58
5.3.6 Western Blot 59
5.3.7 DORA (Dot Blot Receptor Assay) 60
5.3.8 Ligandenbindungstest 61
5.3.9 Sucrosegradient 62
5.3.9.1 Linearer Sucrosegradient 62
5.3.9.2 Diskontinuierlicher Sucrosegradient 63
5.3.10 Percollgradient 64
5.3.11 Nachweis der subzellulären Fraktionen mittels
Markerenzymen 65
6 Literaturverzeichnis 67
7 Abkürzungsverzeichnis 78
8 Danksagung 81
9 Lebenslauf 82
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