Evolution von Mutationen im Polymerasegen des Hepatitis-B-Virus unter antiviraler Therapie:
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2005
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Seite
Abkürzungsverzeichnis IV
1. Einleitung 1
1.1 Epidemiologie und Übertragung 1
1.2 Struktur und Vermehrung des Virus 3
1.2.1 Klassifikation 3
1.2.2 Die Virusstruktur 3
1.2.3 Das Genom 4
1.2.4 Die Proteine und ihre Synthese 6
1.2.4.1 Die Oberflächen- oder Surfaceproteine 6
1.2.4.2 Das Nukleokapsid 7
1.2.4.3 Das „Early -Antigen 8
1.2.4.4 Das Polymeraseprotein 8
1.2.4.5 Das X-Protein 9
1.2.5 Die Replikation 10
1.3 Pathogenese und Pathologie 12
1.4 Krankheitsbild und Verlauf 13
1.5 Prophylaxe und Therapie 16
1.5.1 Prophylaxe 16
1.5.2 Interferon 17
1.5.3 Nukleosidanaloga 17
1.5.3.1 Lamivudin 18
1.5.3.2 Famciclovir 18
1.5.3.3 Adefovir Dipivoxil 19
1.5.4 Aktuelle Therapiestrategien 19
1.6 Mutationsentwicklung unter antiviraler Therapie 20
1.7 Fragestellung der Arbeit 22
2. Methoden 23
2.1 DNA-Extraktion aus dem Serum23
2.2 Polymerase-Kettenreaktion und Mutationsanalyse 23
2.2.1 Herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion 25
2.2.2 Gelelektrophorese 26
II
2.2.3 Echt-Zeit-PCR mit dem LightCycler 26
2.2.4 Mutationsanalyse 27
2.2.5 Reinigung der Amplifikate 29
2.3 Klonierung von PCR-Produkten 30
2.3.1 Ligation 30
2.3.2 Transformation 31
2.3.3 Vermehrung der Plasmidhaltigen Klone 31
2.3.4 Isolation von Plamid 32
2.3.5 Nachweis des HBV-spezifischen Inserts 32
2.4 DNA-Sequenzierung 33
2.4.1 Grundlagen 33
2.4.2 Sequenzierreaktion 34
2.4.3 Ethanol/Natriumacetat-Fällung 34
2.4.4 Sequenzierung 35
2.4.5 Sequenzanalyse und EDV-Programme 35
3. Ergebnisse 36
3.1 Patient und klinischer Verlauf 36
3.2 Bestimmung der Viruslast im LightCycler 39
3.3 Mutationsbestimmung durch Schmelzkurvenanalyse im LightCycler 40
3.4 Bestimmung von Serotyp und Genotyp des Virusgenoms 41
3.5 Vergleich des Wildtyps mit der publizierten Sequenz vom Genotyp A
und Serotyp adw2 44
3.6 Vergleich der Nukleotidsequenzen der Klone aller Proben mit der
Ausgangssequenz 45
3.7 Aminosäureaustausch im Polymeraseleserahmen 50
3.8 Dynamik der Mutationsentwicklung 51
4. Diskussion 53
5. Zusammenfassung 61
6. Literaturverzeichnis 64
Erklärung 70
Danksagung 71
Lebenslauf 72
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