Etablierung eines Modellsystems zur Infektion primärer humaner Hepatozyten mit dem Hepatitis B-Virus:
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2005
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Zusammenfassung „ III
1. Einleitung 1
1.1 Das Hepatitis B-Virus I
1.1.1 Taxonomie 1
1.1.2 Virusmorphologie und -Struktur 2
1.1.2.1 Virale Partikel 2
1.1.2.2 Subvirale Partikel 3
1.1.2.3 Genomstruktur 5
1.1.2.4 Organisation des Genoms 6
1.1.3 Die viralen Transkripte 8
1.1.3.1 Oberflächenprotein 8
1.1.3.2 Core-Protein und Hepatitis B-e-Antigen 9
1.1.3.3 Polymerase 10
1.1.3.4 Hepatitis B-x-Antigen 11
] .2 Der virale Lebenszyklus 12
1.2.1 Infektion der Hepatozyten 12
1.2.2 Kerntransport und cccDNA-Bildung 13
1.2.3 Transkription und Translation 13
1.2.4 Virus-Assembly und -Ausschleusung 15
1.3 Epidemiologie und Übertragung 16
1.4 Klinik der Hepatitis B-Infektion 18
1.5 Pathogenese und Immunantwort 19
1.6 Diagnostik der Hepatitis B-Infektion 20
1.7 Immunprophylaxe 23
1.8 Modelle zum Studium des Hepatitis B-Virus und Ziel der Arbeit 24
2. Material 27
2A Chemikalien und Biochemikalien 27
2.2 Antikörper 28
2.3 Medien und Medienzusammensetzungen 28
2.4 Pufferund Lösungen 29
2.5 Nachweissysteme 30
2.6 Seren und Inokula 31
3. Methoden 32
3.1 Zellkultur 32
3.1.1 Kultur von Hepalom-Zell-Linien 32
3.1.2 Kryokonservation 33
3.1.3 Kultur primärer humaner Hepatozyten 33
3.1.3.1 Isolierung primärer humaner Hepatozyten 33
3.1.3.2 Beschichrung der Zellkulrurgefäße mit Kollagen Typ I 34
3.1.3.3 Aussaat primärer humaner Hepatozyten 35
3.1.3.4 Infektion primärer humaner Hepatozyten mit dem Hepatitis B-Virus 35
3.1.3.5 Inhibition der HBV-Infektion mit polyklonalem anti-HBs 36
3.1.3.6 Inhibition der HBV-Replikation mit Zytokinen 36
3.2 Reinigung und Konzentration viraler Partikel 37
3.2.1 UltraHltration 37
3.2.2 Ultrazentrrfugation 38
3.2.2.1 CsCI-Flotation 38
3.2.2.2 Präparative Ultrazentrifugation 38
3.2.3 PEG-Fällung 39
3.3 Methoden zum Nachweis viraler Antigene und viraler DNA 40
3.3.1 Mtkropartikel-Enzymimmunoassay 40
3.3.2 Immunhistochemie 40
3.3.3 Isolierung viraler Nukleinsäure 41
3.3.4 Quantitativer Nachweis von HBV-DNA 42
I
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse 44
4.1 Etablierung des Infektionsmodells 44
4.1.1 Entfernung des Inokulums aus der Zellkultur nach Infektion 44
4.1.2 Kinetik viraler Antigene und viraler DNA im Zellkulturüberstand 46
4.1.3 Reproduzierbarkeit und Variabilität 48
4.1.4 Immunhistochemische Färbung 50
4.2 Optimierung des Infektionsmodells 52
4.2.1 Einfluss der Kultivierungsbedingungen auf die Infeklionseffektivität 52
4.2.1.1 Zelldichte und Volumen der Collagenmatrix 52
4.2.1.2 DMSO-Zugabe 54
4.2.2 Einfluss der Infektionsbedingungen auf die Infektionseffektivität 55
4.2.2.1 Infektionszeitpunkt 55
4.2.2.2 Virus-Isolate 56
4.2.2.3 Virusmenge im Inokulum 57
4.3 Standardisierung des Infektionsmodells 58
4.3.1 Herstellung eines Referenz-Inokulums 58
4.3.1.1 Produktion viraler Antigene und HBV-Partikel in HepG-Zell-Linien 58
4.3.1.2 Konzentrierung viraler Partikel 58
4.3.1.3 Ultrafiltration 58
4.3.1.4 Ultrazentrirugation 59
4.3.1.5 PEG-Präzipitation 59
4.3.2 Charakterisierung der Inokula mittels CsCl-Flotation 60
4.3.3 Infektion mit konzentrierten HepG2-Zellkulturüberständen 61
4.4 Anwendung des Infektionsmodells 63
4.4.1 Inhibition der Infektion mit polyklonalem anti-HBs 63
4.4.2 Inhibition der Infektion mit Zytokinen 65
5. Diskussion 67
5.1 Nachweis einer erfolgreichen Infektion 67
5.1.1 Methodischer Ansatz 67
5.1.2 Messung viraler Antigene und viraler DNA 68
5.1.3 Immunhistochemischer Nachweis einer Infektion 69
5.2 Einfluss der Zeil-Differenzierung auf die Infektion 70
5.2.1 Einsatz von DMSO 71
5.2.2 Zelldichte 71
5.2.3 Extrazelluläre Matrix 72
5.2.4 Leberzell-Spender 73
5.3 Einfluss des Inokulums auf den Infektionserfolg 73
5.4 Anwendung des Infektionsmodells 75
5.4.1 Wirkung von Zytokinen auf die HBV-Replikation 75
5.4.1.1 Effekt von IFNv 75
5.4.1.2 Effekt von TNFa 76
5.4.2 Untersuchung neutralisierender Eigenschaften von spezifischen Antikörpern 77
6. Literatur 79
7. Anhang 88
7.1 Abkürzungsverzeichnis 88
7.2 Erklärung 90
7.3 Danksagung 91
II
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