Nachweis methylierter chromosomaler Regionen mit methylspezifischer Fluoreszenz in situ Hybridisierung:
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2005
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung 1
2 Einleitung 3
2.1 Historische Entwicklung 4
2.2 DNA Methylierung 5
2.2.1 Funktionen der DNA Methylierung 7
2.2.2 DNA Methylierung in der Tumorgenese 8
2.2.3 DNA Methylierung im Alter 10
2.2.4 Der Mechanismus der Geninaktivierung 11
2.2.5 Genetische Erkrankungen aufgrund von Methylierungsstörungen 12
2.3 Chronisch Myeloische Leukämie 13
2.4 Molekulargenetische Methoden 15
2.4.1 Natriumbisulfitreaktion und methylspezifische Polymerasekettenreaktion..15
2.5 Molekularzytogenetische Methoden 17
2.5.1 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 17
2.5.2 Comparative Genomic Hybridisation 18
2.5.3 Methoden zur Markierung von DNA Proben für FISH und CGH 19
2.6 Überlegungen zum Versuchsaufbau 20
3 Zielstellung 23
4 Material und Methoden 24
4.1 Molekulargenetische Methoden 24
4.1.1 Probenmaterialien 24
4.1.2 Lymphozytenkultur und DNA Isolation 24
4.1.3 Natriumbisulfitreaktion 25
4.1.4 Methylspezifische Polymerasekettenreaktion (MSP) 26
4.1.5 Gelelektrophorese 29
4.1.6 Reagenzien und Geräte 29
4.2 Molekularzytogenetische Methoden 31
4.2.1 Vorbereitung der Metaphasepräparate 31
4.2.1.1 Auftropfen der Zellsuspension auf den Objektträger 32
4.2.1.2 Pepsindigestion und Fixierung 32
I
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 Markierung der genomischen DNA Sonden 33
4.2.2.1 Nick Translation 34
4.2.2.2 PCR mit degenerierten Oligonukleotidprimern 34
4.2.2.3 Bestimmung der Fragmentlängen und Reinigung der Sonden DNA 38
4.2.3 Die eigentliche in situ Hybridisierung 38
4.2.3.1 Denaturierung der Metaphase Präparate 38
4.2.3.2 Prähybridisierung der DNA Sonden 39
4.2.4 Posthybridisierungswaschungen 40
4.2.5 Detektion, Gegenfärbung und Aufnahme 41
4.2.5.1 Detektion 41
4.2.5.2 Gegenfärbung 41
4.2.5.3 Aufnahme 42
4.2.6 Comparative Genomic Hybridization 42
4.3 Bisulfitreaktion und Hybridisierung an Metaphasechromosomen 43
4.4 Reagenzien und Geräte 45
5 Ergebnisse 49
5.1 Molekulargenetische Methoden 49
5.1.1 Natriumbisulfitreaktion und methylspezifische Polymerasekettenreaktion..49
5.2 Zytogenetische Methoden 50
5.2.1 Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung 50
5.2.1.1 Intensität des Fluoreszenzsignals von Chromosomenpaaren einer
Metaphase 50
5.2.1.2 Intensität des Fluoreszenzsignals von homologen Chromosomen 51
5.2.1.3 Zuordnung des Fluoreszenzsignals zu chromosomalen Regionen 52
5.2.2 Comparative Genomic Hybridization 62
5.2.2.1 CGH mit Natriumbisulfit behandelter Normal DNA 63
5.2.2.2 CGH mit Natriumbisulfit behandelter Normal DNA und CML DNA 64
5.2.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung von Tumorzelllinien 66
5.3 Natriumbisulfitreaktion auf Metaphasechromosomen 68
6 Diskussion 69
6.1 Molekulargenetische Methoden 69
6.1.1 Natriumbisulfitreaktion und methylspezifische Poymerasekettenreaktion...69
6.2 Molekularzytogenetische Methoden 70
II
Inhaltsverzeichnis
6.2.1 Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung 70
6.2.1.1 Intensitätsvergleich von chromosomalen Fluoreszenzsignalen 71
6.2.1.2 Zuordnung des Fluoreszenzsignals zu chromosomalen Regionen 71
6.2.2 Comparative Genomic Hybridization 77
6.2.2.1 CGH mit Natriumbisulfit behandelter DNA aus Normalsuspension 78
6.2.2.2 CGH mit Natriumbisulfit behandelter DNA aus Normalsuspension und CML
DNA 79
6.2.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung von Tumorzelllinien 81
6.2.3.1 Ergebnisse der Varianz der Reaktionsparameter 82
6.3 Natriumbisulfitreaktion von Metaphasechromosomen 83
7 Schlußfolgerungen 85
8 Literatur und Quellenverzeichnis 86
9 Anhang 96
III
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