Fluoreszenzspektroskopische Analyse der Interaktionen von Einzeltryptophanmutanten des Katabolit-Kontrollproteins CcpA aus Bacillus subtilis mit Cofaktoren und cre:
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2005
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis IV
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2-.1 Bacillus subtilis: Vorkommen und Lebensweise 2
2.2 Das Phosphoenolpyruvat: Zucker Phosphotransferasesystem (PTS) 2
2.3 Regulation der Genexpression durch DNA-bindende Proteine 3
2.3.1 Lokale Kontrolle der Transkription durch DNA-bindende Regulatorproteine 4
2.3.2 Lokale Kontrolle der Genexpression durch Kohlenstoff-Katabolitenregulation 5
2.3.3 Globale Kontrolle der Genexpression durch Kohlenstoff-Katabolitenregulation 6
2.4 Komponenten der CcpA vermittelten KKR 8
2.4.1 CcpA 8
2.4.2 HPr und Crh als Corepressoren von CcpA 10
2.4.3 Niedermolekulare Effektoren 11
2.4.4 Die Operatorsequenz cre 12
3. Materialien und Methoden 14
3.1 Materialien 14
3.1.1 Chemikalien 14
3.1.2 Hilfsmittel 17
3.1.3 Gerate 18
3.1.4 Reagenziensätze 19
3.1.5 Enzyme und Proteine 19
3.1.6 Oligonukleotide 20
3.2 Bakterienstämme und Plasmide 25
3.2.1 Bakterienstämme 25
3.2.2 Plasmide 25
3J Puffer, Medien und Lösungen 27
3.3.1 Allgemeine Pufferund Lösungen 27
3.3.2 Pufferund Lösungen fürdie Gelelektrophorese 28
3.3.3 Puffer für immunologische Experimente 29
3.3.4 Puffer für die Proteinaufreinigung und Lagerung 29
3.3.5 GrOßenstandards für die Gelelektrophorese 30
Inhaltsverzeichnis il
3.3.6 Bakteriennährmedien 30
3.4 Methoden 32
3.4.1 Allgemeine Methoden 32
3.4.2 Anzucht von Bakterien 33
3.4.3 Ultraschallaufschluss von Zellen 33
3.4.4 Test auf Oberexpression 34
3.4.5 Aufreinigung von CcpA mit carboxytermmalem Hexahistidinanhängsel 34
3.4.6 Aufreinigung von HPr/ Crh und deren Ser46-phosphorylierten Spezies 35
3.4.7 Größenausschlusschromatographie 36
3.4.8 Immunobiot-Analyse 36
3.4.9 ß-Galactosidase-Aktivitätstest in Bacillus sublilis 37
3.4.10 Transformation von Bacillussubtilis 38
3.4.11 Herstellung kompetenter Zellen von Bacillus sublilis 38
3.4.12 Transformation von Bacillus subtilis über natürliche Kompetenz 38
3.4.13 Transformation von Bacillus subtilis durch Elektroporation 39
3.4.14 Kolonie-PCR 40
3.5 Fluoreszenzspektroskopie 40
3.5.1 Allgemeine Vorgehensweise bei der Durchfuhrung fluoreszenzspektroskopischer
Messungen
3.5.2 Korrektur des inneren Filtereffektes 41
3.5.3 Ermittlung von Gleichgewichtsassoziationskonstanten 41
4. Ergebnisse 44
4.1 Konstruktion von CcpA aus B. subtilis mit carboxyterminalem Histidinanhängsel 44
4.1.1 Konstruktion eines Vektors zur Komplementation der AccpA Mutante B. subtilis WH440 44
mit ccpA-his6
4.1.2 Test auf Komplementation von B. subtilis WH440 durch pWH 1541 46
4.2 Konstruktion von Etnzeltryptophanmutanten von CcpA-HI«,: Tryptophanscanning der
Corepressor-Binderegion 47
4.2.1 Konstruktion von Vektoren zur Analyse der Aktivität der CcpA-Tryptophanmutanten in
viv° 48
4.2.2 Quantifizierung der KKR von xynP durch CcpA-Tryptophanmutanten 48
4.2.3 Westem-Blot-Analyse der Expression der ccpA-hise-Mutanten in B. subtilis 52
43 Aufreinigung von CcpA mit carboxyterminalem Hexahistidin-Anhängsel 53
4.3.1 Konstruktion von Vektoren zur Oberexpression der Einzeltryptophanmutanten 53
Inhaltsverzeichnis __ Üi
4.3.2 Überproduktion und Aufreinigung von CcpA-Hisg 55
4.4 Fluoreszenzspektroskopische Analysen zur Interaktion der Einzeltryptophanmutanten
CcpA-His6 Trp mit cre und HPrSer46P/CrhSer46P 57
4.4.1 Interaktion mit cre: Fluoreszenzspektroskopische Eigenschaften von CcpA-His6-lW 57
4.4.2 Korrektur des inneren Filtereffektes (IFE) 59
4.4.3 Interaktion von CcpA-His6-lW mitcre-Elementen ausxynP, ackA und des gn/-Operons
aus B. subtilis £0
4.4.4 Quantifizierung der Interaktion von CcpA-HiS6-lW mit cre-Elementen 62
4.4.5 Einfluss von Fructose-1,6-bisphosphat und Glucose-6-phosphat auf die Interaktion von
CcpA-HiSs-1W mit cre 55
4.4.6 Interaktion mit HPrSer46P 70
5. Diskussion 75
5.1 Die Interaktion von CcpA mit dem Corepressor HPrSer46P 75
5.1.1 Erörterung der funktionellen Bedeutung von Aminosäureresten der Helices I und IX von
CcpA auf struktureller Basis 75
5.1.2 Bestimmung der Bindekonstante der Interaktion von CcpA mit HPrSer46P 80
5.2 Interaktion von CcpA mit cre aus xylA,xynP, ackA und gnt 81
5 J Einfluß niedermolekularer Effektoren auf die CcpA-cre Interaktion 84
6. Literatur 87
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