Etablierung eines Kandidaten-Gen-Arrays zur Identifizierung und Charakterisierung Pankreaskarzinom-assoziierter Gene:
Gespeichert in:
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| Format: | Elektronisch Software E-Book |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2004
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Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungen m
1. Einleitung 1
1.1 Pankreaskarzinom 2
1.2 Funktionelle Genomanalyse 3
1.2.1 Mikroarray Technologie 4
1.2.2 Anwendimg von Mikroarrays 5
Zielsetzung 7
2. Material und Methoden g
2.1 Chemikalien 8
2.2 Organismen und Vektoren 8
2.3 Standard Techniken für Nukleinsäuren 9
2.3.1 Konzentrationsbestimmung 9
2.3.2 Fällung von Nukleinsäuren 9
2.3.3 cDNA Synthese aus RNA 9
2.3.4 PCR (Polymerase Ketten Reaktion) 10
2.3.5 Agarose Gelelektrophorese 11
2.3.6 Formaldehyd Gelelektrophorese 12
2.3.7 Übertrag von RNA auf Nylon Membranen 13
2.3.8 Herstellung einer Digoxygenin markierten DNA Sonde 13
2.3.9 Hybridisierung von Northern Blots 14
2.3.10 Chemilumineszenz Detektion 14
2.3.12 Restriktionsverdau 15
2.3.13 Ligation von DNA Fragmenten 15
2.3.14 Transformation 15
2.3.15 Plasmid Präparation 16
2.3.16 RT PCR Analyse 17
2.3.17 Real Time PCR Analyse 18
2.4 Stabile Transfektion 19
2.5 Herstellung, Hybridisierung und Auswertung eines Kandidaten Gen Arrays 20
Inhaltsverzeichnis II
2.5.1 Konzeption des Kandidaten Gen Arrays 20
2.5.2 Spotting 20
2.5.3 in vitro Modelle 21
2.5.4 RNA Isolierung 22
2.5.5 Markierung der Proben 22
2.5.5.1 Direkte Markierung 22
2.5.5.2 Indirekte Markierung über „Universal Linkage System 23
2.5.5.3 Indirekte Markierung über Aminoallyl für nicht ampiflzierte Proben 23
2.5.5.4 Indirekte Markierung über Aminoallyl für amplifizierte Proben 24
2.5.6 Hybridisierung 25
2.5.7 Scannen und Bildverarbeitung 27
2.5.8 Auswertung 27
3. Ergebnisse 29
3.1 Entwicklung des Kandidaten Gen Arrays 29
3.1.1 Auswahl der Kandidaten Gene 29
3.1.2 Etablierung der Spotting Bedingungen 30
3.1.3 Optimierung der Proben Markierung 33
3.1.4 Optimierung der Hybridisierungsbedingungen 33
3.2 Charakterisierung des Hybridisierungsverhaltens des 70 mer Oligonukleotid Arrays 35
3.3 Identifikation und Charakterisierung potentiell relevanter Kandidaten Gene 42
3.4 Charakterisierung des humanen HOXC9 Gens 48
4. Diskussion 56
4.1 Kandidaten Gen Array 56
4.2 serielle Charakterisierung der Kandidaten Gene 59
4.3 Das humane HOXC9 Gen 61
5. Zusammenfassung 65
6. Literatur 66
Danksagungen 78
Lebenslauf 79
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