Untersuchungen zur Regulation von CFTR-Chloridkanälen durch Nukleotide und Phosphatidylinositolphosphate:
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| Format: | Abschlussarbeit Elektronisch Software E-Book |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2004
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
9
1.1
MEMBRANPROTEINE
UND
TRANSPORT
9
1.2
CFTR
=
CYSTIC
FIBROSIS
TRANSMEMBRANE
CONDUCTANCE
REGULATOR
10
1.2.1
GESCHICHTE
DES
CFTR
11
1.2.2
ABC-PROTEINE
12
1.2.3
STRUKTUR
DES
CFTR
14
1.2.4
FUNKTION
DES
CFTR
UND
ZYSTISCHE
FIBROSE
15
1.3
REGULATION
DES
CFTR
17
1.3.1
PHOSPHORYLIERUNG
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
17
1.3.2
ATP-BINDUNG
UND
HYDROLYSE
19
1.3.3
ALTERNATIVE
REGULATIONSMECHANISMEN
25
1.4
PHOSPHOLIPIDE
26
1.4.1
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
PIPA
26
1.4.2
REGULATION
VON
LONENKANAELEN
UND
TRANSPORTERN
28
1.5
ELEKTROPHYSIOLOGIE
AN
XENOPNS-OOZYTEN
31
1.5.1
DAS
AERTOPUS-EXPRESSIONSSYSTEM
31
1.5.2
ELEKTRISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
MEMBRANEN
33
1.5.3
PRINZIP
DER
SPANNUNGSKLEMME
(VOLTAGE
CLAMP)
34
1.5.4
PRINZIP
DER
PATCH-CLAMP-TECHNIK
3
5
2
MATERIAL
UND
METHODEN
37
2.1
CHEMIKALIEN 37
2.2
GERAETE
UND
SOFTWARE
38
2.2.1
MOLEKULARBIOLOGIE
38
2.2.2
RNA-INJEKTION
39
2.2.3
ELEKTROPHYSIOLOGIE
39
2.2.4
SOFTWARE
39
2.3
VERWENDETE
LOESUNGEN
40
2.3.1
AUFBEWAHRUNG
UND
PRAEPARATION
DER
OOZYTEN
40
2.3.2
LOESUNGEN
FUER
DIE
PATCH-CLAMP-TECHNIK
41
2.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
43
2.4.1
HERSTELLUNG
DER
MUTANTEN
K464A
BZW.
K464A
/
K1250A
43
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.2
HERSTELLUNG
DER
CRNA
FUER
DIE
INJEKTION
IN
OOZYTEN
44
2.5
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
XENOPUS
LAEVIS-OOZYTEN
44
2.5.1
GEWINNUNG
DER
XENOPUS
LAEVIS-OOZYTEN.
44
2.5.2
INJEKTION
DER
CRNA
45
2.6
DIE
PATCH-CLAMP-TECHNIK 46
2.6.1
HERSTELLUNG
DER
PATCHPIPETTEN 46
2.6.2
VORBEREITUNG
DER
OOZYTE
FUER
DIE
MESSUNG 46
2.6.3
BILDUNG
DES
GIGASEAL
UND
VESIKELTEST
47
2.6.4
DURCHFUEHRUNG
DER
MESSUNG
48
2.6.5
DATENVERARBEITUNG
49
3
ERGEBNISSE
I:
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
PKA
UND
ATP-ABHAENGIGEN
REGULATIONSMECHANISMUS
DES
CFTR
50
3.1
GRUNDLAGEN
DER
CFTR-MESSUNG
IM
ISOLIERTEN
MAKROPATCH
50
3.1.1
ENDOGENE
CHLORIDKANAELE
IN
DER
OOZYTENMEMBRAN
50
3.1.2
CFTR-PHOSPHORYLIERUNG
IM
ISOLIERTEN
MAKROPATCH
51
3.1.3
GRUNDLAGEN
DER
OEFFNUNGS
UND
SCHLIESSKINETIK
DES
CFTR
53
3.1.4
ATP-AFFINITAET
56
3.1.5
AUSWERTUNG
VON
STROM-SPANNUNGS-KENNLINIEN
58
3.2
WEITERFUEHRENDE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ATP-BINDUNG
/
HYDROLYSE
AM
CFTR-WILDTYP
60
3.2.1
STATIONAERE
STROEME
UNTER
MG
2+
-FREIEN
BEDINGUNGEN
60
3.2.2
ATP-AFFINITAET
UNTER
MG
2+
-FREIEN
BEDINGUNGEN
61
3.2.3
OEFFNUNGS
UND
SCHLIESSKINETIK
UNTER
MG
2+
-FREIEN
BEDINGUNGEN
62
3.2.4
EINFLUSS
VON
AMP-PNP
AUF
STATIONAERE
UND
ZEITAUFGELOESTE
STROEME
63
3.2.5
EINFLUSS
VON
ADP
AUF
STATIONAERE
UND
ZEITAUFGELOESTE
STROEME
64
3.3
MESSUNGEN
AN
DER
CFTR-MUTANTE
K464A
IN
GEGENWART
VON
MG
2+
66
3.3.1
STATIONAERE
STROEME
DER
CFTR-MUTANTE
K464A
66
3.3.2
KINETISCHE
AUSWERTUNGEN
DER
CFTR-MUTANTE
K464A
67
3.3.3
AUSWIRKUNGEN
DER
MUTATION
K464A
AUF
DIE
MGATP-AFFINITAET
70
3.4
WEITERFUEHRENDE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ATP-BINDUNG
/
HYDROLYSE
AN
DER
CFTR-MUTANTE
K464A
72
3.4.1
STATIONAERE
STROEME
DER
MUTANTE
K464A
UNTER
MG
2+
-FREIEN
BEDINGUNGEN
72
3.4.2
AUSWIRKUNGEN
DER
MUTATION
K464A
AUF
DIE
TRISATP-AFFINITAET
73
6
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.3
OEFFNUNGS
UND
SCHLIESSKINETIK
DER
MUTANTE
K464A
UNTER
MG
2+
-FREIEN
BEDINGUNGEN
74
3.4.4
EINFLUSS
VON
AMP-PNP
AUF
STATIONAERE
UND
ZEITAUFGELOESTE
STROEME
DER
MUTANTE
K464A
75
3.4.5
EINFLUSS
VON
ADP
AUF
STATIONAERE
UND
ZEITAUFGELOESTE
STROEME
DER
MUTANTE
K464A
77
3.5
MESSUNGEN
AN
DER
DOPPELMUTANTE
K464A
/
KL
250
A
78
3.5.1
STATIONAERE
STROEME
DER
DOPPELMUTANTE
K464A
/
K1250A
78
3.5.2
KINETISCHE
AUSWERTUNGEN
DER
CFTR-DOPPEHNUTANTE
K464A
/
KL
250
A
80
3.5.3
EINFLUSS
VON
AMP-PNP
AUF
STATIONAERE
UND
ZEITAUFGELOESTE
STROEME
DER
DOPPELMUTANTE
K464A
/
KL250A
81
3.5.4
EINFLUSS
VON
ADP
AUF
DIE
DOPPELMUTANTE
K464A
/
K1250A
83
4
ERGEBNISSE
II:
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PIP
2
-INDUZIERTEN
PROTEIN
KINASE-UNABHAENGIGEN
REGULATION
VON
CFTR
84
4.1
PIP
2
-EFFEKT
AUF
UNPHOSPHORYLIERTE
CFTR-KANAELE
IM
MAKROPATCH
84
4.1.1
AKTIVIERUNG
VON
CHLORID-STROEMEN
DURCH
PIP
2
IM
MAKROPATCH
84
4.1.2
OEFFNUNGS
UND
SCHLIESSKINETIK
DER
PIP
2
-AKTIVIERTEN
CHLORIDSTROEME
88
4.1.3
POTENTIELLE
ATP-ABHAENGIGE
PIP
2
-SYNTHESE
DURCH
ENDOGENE
LIPIDKINASEN
90
4.2
PIP
2
-EFFEKT
AUF
UNPHOSPHORYLIERTE
CFTR-KANAELE
IN
EINZELKANALMESSUNGEN
93
4.2.1
AKTIVIERUNG
VON
CHLORIDKANAELEN
DURCH
PIP
2
IN
EINZELKANALMESSUNGEN
93
4.2.2
ERMITTLUNG
DER
LEITFAEHIGKEIT
PIP
2
-INDUZIERTER
CFTR-EINZELKANAELE
94
4.3
EFFEKT
VON
PIP
2
AUF
PHOSPHORYLIERTE
CFTR-KANAELE
96
4.3.1
PIP
2
-INDUIZERTE
STATIONAERE
STROEME
96
4.3.2
KINETISCHE
AUSWERTUNGEN
DES
OEFFNENS
UND
SCHLIESSENS
97
4.4
EINFLUSS
VON
PHOSPHATGRUPPEN
UND
ARACHIDONSAEURE
AUF
DIE
CFTR
AKTIVIERUNG
98
4.4.1
VERGLEICH
VON
PI,
PIP
UND
PIP
2
98
4.4.2
EFFEKT
VON
ARACHIDONSAEURE
AUF
CFTR-KANAELE
99
4.5
ATP-ABHAENGIGKEIT
DER
PIP
2
-AKTIVIERUNG
103
4.5.1
PIP
2
-INDUZIERTE
STATIONAERE
STROEME
103
4.5.2
KINETISCHE
AUSWERTUNG
DER
KANALOEFTHUNG
104
4.6
PROTEINKINASE-UNABHAENGIGE
AKTIVIERUNG
DURCH
PIP
2
105
4.6.1
PIP
2
-APPLIKATION
UNTER
MG^-FREIEN
BEDINGUNGEN
105
4.6.2
SUBSTITUTION
VON
AMP-PNP
FUER
ATP
106
7
INHALTSVERZEICHNIS
5
DISKUSSION
I:
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
DER
BEIDEN
NUKLEOTID-
BINDEDOMAENEN
UND
ZUR
AUFSTELLUNG
EINES
ERWEITERTEN
GATING-
MECHANISMUS
109
5.1
UNTERSUCHUNGEN
DES
CFTR
IN
GEGENWART
VON
MAGNESIUM
110
5.1.1
EXPRESSION
DES
CFTR
IN
OOZYTEN
110
5.1.2
OEFFNUNGSMECHANISMUS
DES
CFTR
111
5.1.3
SCHLIESSMECHANISMUS
DES
CFTR
113
5.2
UNTERSUCHUNGEN
DES
CFTR
UNTER
MG
2+
-FREIEN
BEDINGUNGEN
117
5.2.1
NICHT-HYDROLYTISCHER
OEFFNUNGSMECHANISMUS
DES
CFTR
117
5.2.2
NICHT-HYDROLYTISCHER
SCHLIESSMECHANISMUS
DES
CFTR
120
5.3
ERSTELLUNG
EINES
ERWEITERTEN
GATING-MECHANISMUS
122
6
DISKUSSION
II:
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROTEINKINASE-UNABHAENGIGEN
REGULATION
VON
CFTR
DURCH
PHOSPHATIDYLINOSITOLPHOSPHATE
124
6.1
EFFEKT
VON
PIP
2
AUF
UNPHOSPHORYLIERTE
CFTR-KANAELE
124
6.1.1
AKTIVIERUNG
VON
CFTR-CHLORIDKANAELEN
DURCH
PIP
2
125
6.1.2
PIP
2
-SYNTHESE
IM
ISOLIERTEN
MAKROPATCH
127
6.1.3
ATP-ABHAENGIGKEIT
DER
PIP
2
-INDUZIERTEN
STROEME
128
6.2
PROTEINKINASE-UNABHAENGIGE
AKTIVIERUNG
VON
CFTR-KANAELEN
DURCH
PIP
2
129
6.2.1
MESSUNGEN
UNTER
MG
2+
-FREIEN
BEDINGUNGEN
129
6.2.2
SUBSTITUTION
VON
ATP
MIT
AMP-PNP
130
6.3
ALTERNATIVER
PIP
2
-INDUZIERTER
REGULATIONSMECHANISMUS
AN
CFTR-KANAELEN
131
6.3.1
DIREKTE
INTERAKTION
ZWISCHEN
PHOSPHATIDYLINOSITOLPHOSPHATEN
UND
PROTEINEN
131
6.3.2
PIP
2
-REGULATION
IN
DER
NATIVEN
ZELLE
135
7
ZUSAMMENFASSUNG
137
8
LITERATURVERZEICHNIS
140
9
ABKUERZUNGEN
150
10
DANKSAGUNG
152
11
LEBENSLAUF
153
8 |
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