Regulation der Transkription und Apoptose durch die p53-Tumorsuppressorfamilie:
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2004
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Apoptose 1
1.2 Zellzyklusregulation, Onkoproteine und Tumorsuppressorproteine 3
1.3 Das Tumorsuppressorprotein p53 5
1.4 p63 undp73 8
1.5 Aufgabenstellung 11
2. Material 12
2.1 Bezugsquellen 12
2.1.1 Chemikalien 12
2.1.2 Enzyme 13
2.1.3 Chemikalien Zusammensetzungen (Kits) 13
2.1.4 Verbrauchsmaterial 13
2.1.5 Geräte 14
2.2 Zelllinie 14
2.3 Tet off Genexpressions System 15
3. Methoden 17
3.1 Zellkultur 17
3.1.1 Kultivierung der stabil transfizierten DLDl Zellen 17
3.1.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen 18
3.1.3 Induktion des Tet off Genexpressionssystems 19
3.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) 20
3.2.1 Primer, RT PCR Ansätze, Kontrollstandards 21
3.2.2 Isolation der Gesamt RNA aus DLDl Zellen 23
3.2.3 Menge und Reinheit der isolierten RNA 24
3.3 Caspase 3 Assay 25
3.4 FACS Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) 26
3.5 Darstellung der Fragmentierung der genomischen DNA mit Hilfe einer Agarose
gelelektrophorese 27
3.5.1 Isolation der genomischen DNA aus DLDl Zellen 27
3.5.2 Menge und Reinheit der isolierten DNA 28
3.5.3 Analytische Agarosegelelektrophorese 28
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse 29
4.1 mRNA und Protein Expression der untersuchten Transgene 30
4.2 Transkriptionelle Aktivierung von p21 durch p53, p63 und p73 32
4.3 Induktion der Apoptose durch p53 und seine Homologen p63 und p73 35
4.3.1 Aktivitätsbestimmung der Protease Caspase 3 35
4.3.2 Bestimmung der apoptotischen SubGl Population durch FACS
Analyse 38
4.3.3 Detektion von Apoptose in Kolonkarzinomzellen durch DNA
Leiterbildung 48
5. Diskussion 52
5.1 Transkriptionelle Aktivierung durch p53, p63 undp73 53
5.2 Induktion von Apoptose durch p53, p63 und p73 56
5.3 Zusammenfassende Beurteilung der Eigenschaften von p63 und p73 im
Vergleich zum Tumorsuppressor p53 61
6. Zusammenfassung 63
Literaturverzeichnis I
Anhang IX
Erklärung über eigenständige Abfassung der Arbeit XI
Lebenslauf XII
Danksagung XIII
Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen und Vorträge XIV
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