Das autokrin Fibronektin-induzierte Migrationsverhalten von humanen intestinalen Myofibroblasten bei Patienten mit Morbus Crohn:
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2005
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Kinleitung I
1.1 Morbus Crohn und Colilis ulccrosu I
1.2 Aufbau der Dannwand 4
1.3 Mögliche Komplikationen bei Morbus Crohn und C olitis uleerosa 5
1.3.1 Gestörte Wundheilung und Bildung von Fisteln 5
1.3.2 Überschießende Wundheilung und Entstehung von Stenosen ft
1.4 Migration von Fibroblasten und Myofibroblaslen 8
1.5 Morphologie sich bewegender Fibroblasten: Mikrospikes und Lamellipodien 10
1.6 Die Migration von Zellen ist aktinabhangig 11
1.7 Wachstumstaktoren. Zytokine und Fibronektin und ihre Bedeutung liir die 13
Zellniigration
1.7.1 Wachstumslaktoren 13
1.7.2 Enl/ündungsmediatoren: TNF und IFNy 14
1.7.3 Die Extra/ellularmatrix Komponentc Fibroneklin Ift
1.8 Arbeitsziele I1J
2 Materialien und (ieräte 21
2.1 Chemikalien 21
III
2.1.1 Zellkultur 21
2.1.2 Immunhistochemie 21
2.1.3 Migrations Assay in der modifizierten Boydenkammer 22
2.1.3.1 Zytokine 22
2.1.3.2 Extrazellularmatrixprotein 22
2.2 Sonstige Verbrauchsmaterialien 22
2.3 Geräte 23
2.3.1 Laborausstattung 23
2.3.2 Lasertechnik 24
3 Methoden 25
3.1 Isolation und Kultur von primären humanen intestinalcn Myofibroblasten 25
3.2 Herstellung von konditionierten Medien 27
3.3 Bestimmung der Zellzahl 28
3.4 Immunhistochemische Färbung 29
3.4.1 Aussaat der Zellen auf 2 well chamber slides 29
3.4.2 Fixierung der Zellen 30
3.4.3 Farbeverfahren mit dem Universal DAKO APPAP Kit 30
3.5 Migrations Assays mit der modifizierten 48 well Boydenkammer 32
3.5.1 Arbeitsschritte mit der modifizierten 4S well Boydenkammer 32
3.5.2 Färben der migrierten Zellen auf der Membran 34
IV
3.6 Konditionierung von Medien 35
3.7 Herstellung der dreidimensionalen Myofibroblasienmatrix 35
3.7.1 Hintergrund 35
3.7.2 Vorbereitungen 36
3.7.3 Matrix 36
3.8 Zelllyse mittels Erbium:YAG Laser 37
3.8.1 Hintergrund 37
3.8.2 Erzeugung eines kreisrunden Defektes im Zellrasen bei erhaltener ECM 38
3.8.2.1 Ablauf 39
3.8.2.2 Dokumentation 40
4 Ergebnisse 41
4.1 Migrationsexperimente mit der modifizierten Boydenkammer 41
4.1.1 Morbus Crohn Myofibroblasten aus stenosierten, fistulierten und entzündlich 41
veränderten Bereichen zeigen in vitro unterschiedliche Migrationsverhalten.
4.1.1.1 Migration auf konditioniertem Medium von MC CLPF aus entzündeter 43
Mucosa
4.1.1.2 Migration auf konditioniertem Medium von Fibroblasten aus Stenosearealen 45
4.1.1.3 Migration auf konditioniertem Medium von Fibroblasten aus fistulierten 47
Bereichen
4.1.1.4 Mittelwerte aus den drei Versuchsansätzen mit unterschiedlich konditionierten 49
Medien
4.1.2 Unterschiedliche Migration der Stenose . Fistel und MC CLPF aus 51
entzündeter Mucosa unter Einfluss steigender Konzentrationen der
Matrixkomponente Fibronektin
4.1.2.1 Fibronektin (lOug/ml) 52
V
4.1.2.2 Fibronektin (25ug/ml) 53
4.1.2.3 Fibronektin (50^g/ml) 55
4.1.3 Der Einfluss der Entzündungsmediatoren IFNy und TNF auf die Migration 57
von Morbus Crohn Myofibroblasten aus entzündlich veränderten Darmarealen
4.1.3.1 IFNy ist ein potenter Inhibitor der Zellmigration von Morbus Crohn 57
Myofibroblasten
4.1.3.2 TNF hat keinen Einfluss auf das Migrationsverhalten der CLPF bei Morbus 58
Crohn
4.2 Migrationsversuche mit einer von Fibroblasten induzierten dreidimensionalen 60
Matrix
4.2.1 Quantitative Auswertung 61
4 2.2 Qualitative Beobachtung und Beschreibung des Migrationsverhaltens 63
4.2.2.1 Beobachtungen während und nach der Migration der Fibroblasten aus 63
entzündeter Mucosa (MC CLPF)
4.2.2.2 Beobachtungen während und nach der Migration der Stenosefibroblasten 64
4.2.2.3 Beobachtungen während und nach der Migration von Fibroblasten aus 65
fistulierten Darmarealen
5 Diskussion 68
5.1 Das Fibronektin induzierte Migrationsverhalten unterscheidet sich bei 68
Myofibroblasten aus stenosierten, fistulierten und entzündeten Darmarealen
von Patienten mit Morbus Crohn.
5 2 |FNy bewirkt eine signifikante Reduktion des Migrationspotentials von 70
Morbus Crohn Myofibroblasten.
5 3 Das Migrationspotential von Morbus Crohn Myofibroblasten aus stenosierten, 74
fistulierten und entzündeten Darmabschnitten im dreidimensionalen
Migrationsmodell
6 Zusammenfassung
VI
7 Literaturverzeichnis 79
8 Danksagung 1()l
VII
|
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