Entwicklung rekombinanter bispezifischer single-chain Fv Antikörper-Derivate zur Effektorzell-vermittelten Lyse maligner B-lymphoider Zellen:
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Inhaltsverzeichnis
Seite
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
2. EINLEITUNG 3
2.1. Leukämien und Lymphome 3
2.1.1. Formen von Leukämien 4
2.1.2. Therapie von Leukämien 6
2.1.3. Nebenwirkungen und Limitierungen der konventionellen Therapien 8
2.2. Neue Ansätze der Leukämietherapie 9
2.2.1. Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 10
2.2.2. Induktion einer tumorgerichteten T-Zellantwort 13
2.2.3. Therapie mit monoklonalen Antikörpern 14
2.2.4. Limitierungen der Therapie mit konventionellen monoklonalen Antikörpern 16
23. Bispezifische Antikörper als neue Immuntherapeutika 17
2.3.1. Formate bispezifrscher Antikörper 18
2.4. Zielstrukturen auf Tumorzellen 20
2.4.1. Zielantigene auf malignen B-lymphoiden Zellen 21
2.4.2. HLA Klasse II als Zielantigen auf malignen B-lymphoiden Zellen 22
2.4.3. CD19 als Zielantigen auf malignen B-lymphoiden Zellen 23
2.5. Zielstrukturen auf Effektorzellen 24
2.5.1. Der niedrig affine Fcy-Rezeptor III (CD 16) 25
3. PROBLEMSTELLUNG 27
4. ERGEBNISSE 28
4.1. Herstellung eines bispezifischen single-chain Fv [HLA Klasse II x CD16| 28
4.1.1. Klonierung von scFv-Fragmenten aus etablierten Hybridomzelllinien 28
4.1.2. Überprüfung der spezifischen Bindung beider scFv-Fragmente 30
4.1.3. KonitntokmdciExptetwoMvektonfilr den bsscFv[HLA Klasse II xCD16] 32
4.1.4. Exprasmt und Aufieiaigung da rekombinanten bsscFv [HLA Klasse II x
CD16] 33
4.1.5. Bestimmung der Affinitatskonstanten der scFv-Leseköpfe des bsscFvs [HLA
Klasse II xCD16] 33
4.1.6. Bestimmung der Stabilität des bsscFv [HLA Klasse II x CD16] in humanem
Serum 37
4.1.7. Untersuchungen zur Vermittlung der Antikörper-abhangigen zellulären
Zytotoxizitat(ADCC) durch den bsscFv [HLA Klasse II xCD16] 38
4.2. Herstellung eines CD 19- und CD16-gerichteten bsscFv-Antikörpers 42
4.2.1. Stabilisierung von scFv-Fragmenten über eine intramolekulare
Disulfidbrücke 42
4.2.2. Konstruktion des Expressionsvektors für den bsscFv [CD19xCD16] 44
4.2.3. Expression und Aufreinigung des rekombinanten bsscFv ds[CD19 x CD16] 45
4.2.4. Funktionelle Charakterisierung des Disulfidbrücken-stabilisierten bsscFv
ds[CD19xCD16] 46
4.2.5. Untersuchungen zur Vermittlung ADCC durch den bsscFv ds[CD19xCD16] 49
4.2.6. Zytotoxische Aktivität des bsscFv ds[CD19 x CD16] gegenüber primären
humanen Tumorzellen 51
5. DISKUSSION 56
6. MATERIAL UND METHODEN 67
6.1. Materialien 67
6.1.1. Chemikalien und Enzyme 67
6.1.2. Allgemeine Puffer und Lösungen 67
6.1.3. Vektoren 67
6.1.4. Oligonukleotide 68
6.1.5. Bakterienstämme 68
6.1.6. Zelllinien 69
6.1.7. Zellkulturmedien 70
6.1.8. Antikörper 70
6.2. Methoden 71
IntiM Itsvcrzcichnis
6.2.1. Standardmethoden 71
6.2.2. Klonierungen 71
6.2.3. Bakterielle Expression und Aurreinigung der scFv-Fragmente 73
6.2.4. Expression des bsscFv [HLA Klasse II x CD16] in SF21 Insektenzellen 74
6.2.5. Expression der bsscFv [CD19 x CD19], ds[CD19 x CD16], CD16ex-GFP-,
scFv-GFP- und scFv-RFP-Konstrukte in 293T Zellen 74
6.2.6. SDS-PAGE und Western-Transfer Experimente: 75
6.2.7. Isolierung von mononuklearen Zellen (MNCs), polymorphnukleären Zellen
(PMNs), Plasma und CLL Tumorzellen 75
6.2.8. Isolierung von Transplantat-abgeleiteten MNCs von Patienten nach
Transplantation 75
6.2.9. Anreicherung von CD56+Zellen 76
6.2.10. Durchflusszytometrie 76
6.2.11. Bestimmung der Affinitätskonstanten (KD) für Antikörper und scFv-
Komponenten durch Immunfluoreszenz 77
6.2.12. Surface Plasmon Resonanz 77
6.2.13. Zytotoxizitätsexperimente 78
6.2.14. Statistische Analysen 79
7. LITERATUR 80
8. WEITERE INFORMATIONSQUELLEN, INTERNETSEITEN 95
9. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 96
10. NACHDRUCKE DER EIGENEN VERÖFFENTLICHUNGEN 98
i**w*»¦* Verzeichnis der AbbUdnngea Scllc
Abbildung 1: Prozentualer Anteil an Neuerkraalnrngen der häufigsten Krebsformen in
Deutschland 2000 3
Abbildung 2: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper U
Abbildung 3: Generierung einer tumorreaktiven T-ZeUantwort durch monoklonale
Antikörper 13
Abbildung 4: Formate bispezifischer Antikörper 20
Abbildung 5: Expression von Differenzierungsantigenen in der B-Zell-Entwicklung 21
Abbildung 6: Amplifikation der variablen Regionen der leichten und schweren Kette
aus den Hybridomzelllinien F3.3 und 3G8 28
Abbildung 7: Verknüpfung der variablen Regionen der leichten und schweren Kette
von F3.3 und 3G8 durch Overlap-PCR 29
Abbildung 8: Spezifische Bindung der scFv-Fragmente an HLA Klasse II und CD16 31
Abbildung 9: Design des rekombinanten bsscFv Antikörpers [HLA Klasse II x CD16] 32
Abbildung 10:Aufreinigung und Nachweis des rekombinanten bsscFv [HLA Klasse II
x CD16] aus Insektenzellen 33
Abbildung 11: Spezifische und simultane Bindung des bsscFv [HLA Klasse II x CD 16] 34
Abbildung 12:Bestimmung der Assoziations - und Dissoziationskonstanten und der
Affinität des CD16-Lesekopfes im bsscFvs und des F(ab)2-Fragmentes
des 3G8 Antikörpers für die extrazelluläre Domäne von CD16 35
Abbildung 13:Bestimmung der Affinitätskonstanten der HLA Klasse II-scFv-
Komponente im bsscFv und des F(ab)-Fragmentes des F3.3
Parentalantikörpers 36
Abbildung 14:Stabilität des rekombinanten bsscFv [HLA Klasse II x CD16] in
humanem Serum 38
Abbildung 15 :Der rekombinante bsscFv [HLA Klasse II x CD16] vermittelt
spezifische Lyse maligner humaner B-lymphoider Zelllinien, die
verschiedene Reifungsstadien repräsentieren 39
Abbildung 16:Identifizierung der Subpopulation von humanen periphären
Blutlymphozyten, welche die Lyse von ARH-77 Zellen in Verbindung
mit dem bsscFv [HLA Klasse II x CD16] vermitteln 40
Abbildung 17:Der rekombinante bsscFv [HLA Klasse II x CD16] induziert
Effektorzell-vermittelte Lyse primärer humaner leukämischer B-CLL
Zellen 41
Abbildung 18:Schema der Stabilisierung eines scFv-Fragments durch Einfügen einer
Disulfidbrücke
Inhaltsverzeichnis
Abbildung 19:Design des rekombinanten Disulfid-stabilisierten bsscFv Antikörpers
ds[CD19xCD16] 44
Abbildung 20:Aufreinigung und Nachweis des rekombinanten Disulfidbrücken-
stabilisierten bsscFv ds[CD19 x CD16] 45
Abbildung 21:Spezifische und simultane Bindung des Disulfidbrücken-stabilisierten
bsscFv ds[CD19xCD16] 47
Abbildung 22:Stabilität des Disulfidbrucken-stabilisierten bsscFv ds[CD19 x CD16]
in humanem Serum bei 37°C im Vergleich zu dem unstabiliserten
bsscFv [CD19xCD16] 48
Abbildung 23:Abhängigkeit der spezifischen Tumorzelllyse von der
Antikörperkonzentration und dem Effektor-zu-Zielzell Verhältnis 50
Abbildung 24: Identifizierung des Subpopulation von humanen periphären
Blutlymphozyten, welche die Lyse von ARH-77 Zellen in Verbindung
mit dem bsscFv ds[CD19 x CD 16] vermitteln 51
Abbildung 25:Zytotoxische Aktivität des bsscFv ds[CD19 x CD16] gegen primäre
CD19-positive B-CLL Zellen im Vergleich zu dem Chimären igGl
Antikörper CD19 4G7chim 52
Abbildung 26:Zytotoxische Aktivität des bsscFv ds[CD19 x CD16] gegen primäre
CD19-positive pro-B/cALL Blasten im Vergleich zu dem Chimären
IgGl Antikörper CD19 4G7chim 53
Abbildung 27:Zytotoxische Aktivität des bsscFv ds[CD19 x CD16] gegen primäre
CD19-positive pro-B/cALL Blasten mit Donor-abgeleiteten
Effektorzellen von Patienten nach einer Transplantation 54
Verzeichnis der Tabellen Seite
Tabelle 1: Übersicht über die 4 Leukämieformen, ihrer Therapieoptionen und
Heilungsraten 6
Tabelle 2: Für die Krebstherapie von der FDA zugelassene Antikörper 15
Tabelle 3: Obersicht der Effektorzellen des Immunsystems und ihrer
Triggermoleküle und aktivierenden Zytokine 25
Tabelle 4: Obersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien 69
Tabelle 5: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper 70
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