Die Rolle der NADPH-Oxidase bei der Thrombin-induzierten Signaltransduktion in glatten Muskelzellen:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2004
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| Beschreibung: | Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2005 |
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|---|---|
| adam_text | A. Einleitung 5
1. Die Interaktion von Faktoren im Blut und glatten Muskelzellen spielt
eine zentrale Rolle bei der Antwort auf Gefäßwandschäden 5
1.1. Die Schutzfunktion des Endothels kann durch eine Vielzahl an Faktoren
beeinflusst werden 5
1.2. Durch Endothelschäden werden Gefäßumbauprozesse aktiviert 6
1.3. Durch Zerstörung der endothelialen Barriere kommt es zur Interaktion von
Thrombozyten und Subendothel 7
1.4. Der Gerinnungsprozess wird durch Verletzung der Gefäßwand initiiert und auf
zwei unterschiedlichen Wegen aktiviert 7
1.5. Der Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) ist an Gefäliumbauprozessen
beteiligt 8
1.6. Thrombin interagiert direkt mit vaskulären Zellen 9
1.7. Die Aktivierung von Kinasen spielt eine wichtige Rolle bei der Antwort auf
Gefäßwandschäden 10
1.7.1. MAP Kinasen 10
1.7.2. Proteinkinase B/Akt 11
2. Der Hypoxie-induzierbare Faktor-1 (H1F-1) induziert Gene, die an
Remodellingprozessen der Gefäßwand beteiligt sind 13
2.1. Endothelverletzungen führen zur Aktivierung angiogenetisch wirksamer Faktoren 13
2.2. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 (Hypoxie-induzierbarer Faktor-1) vermittelt die
Expression angiogenetisch wirksamer Faktoren unter Hypoxie 13
3. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind an Remodellingprozessen der
Gefäßwand beteiligt 18
3.1. Gefäßwandschäden führen zur vermehrten Bildung von reaktiven Sauerstoff- 18
Spezies (ROS)
3.2. Für die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) benötigen Leukozyten 19
die NADPH Oxidase
3.3. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können zellulären Signalfunktionen dienen 19
3.4. NADPH Oxidasen werden auch in nicht-phagozytären Zellen exprimiert 21
4. Ziel der Arbeit 22
1
B. Materialien und Methoden 23
1. Materialien 23
1.1. Bakterien, Plasmidkonstrukte und Oligonukleotide 23
1.1.1. Bakterien 23
1.1.2. Plasmidkonstrukte 23
1.1.2.1. Reportergene 23
1.1.2.2. Weitere Plasmidkonstrukte 23
1.1.3. Oligonukleotide 25
1.2. Antikörper 25
1.3. Enzyme 27
1.4. Nachweis-, Reinigungs- und Synthesesysteme („Kits ) 29
1.5. Stammlösungen 29
1.6. Chemikalien 30
1.7. Sonstige Materialien 31
2. Methoden 32
2.1. Zellkultur und Gefäßpräparation 32
2.1.1. Humane glatte Muskelzellen 32
2.1.2. Humane Blasenkarzinom-Zellen 32
2.1.3. Präparation von humanen Nierenarterien 33
2.2. Molekularbiologische Methoden 33
2.2.1. Herstellung von Plasmid DNA 33
2.2.1.1. Transformation von E. coli mit dem Ligationsansatz 33
2.2.1.2. Isolierung und Analyse von Plasmid-DNA (Minipräparation) 34
2.2.1.3. Isolierung und Analyse von Plasmid-DNA (Maxipräparation) 37
2.2.2. Transfektionen 38
2.2.2.1. Reportergenanalysen 38
2.2.2.2. Transfektion von Antisense-Oligonukleotiden 39
2.2.3. RNA Isolierung 40
2.2.4. Quantifizierung von mRNA durch Northern Blot Analyse 41
2.3. Western-Blot-Analyse 46
2.4. Immunfluoreszenz 52
2.5. Kernextraktpräparationen 53
2.6. Electrophoretic Mobility Shirt Assay (EMSA) 54
2.7. Dichlorofluorescin (DCF) Fluoreszenz 58
2.8. Untersuchung der prokoagulatorischen Aktivität 58
2.9. Statistik 59
2
C. Ergebnisse 60
1. Thrombin stimuliert die NADPH Oxidase-abhängige ROS Produktion:
Rolle bei der Aktivierung von p38 MAP Kinase und Proteinkinase B/Akt 60
1.1. Thrombin stimuliert die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in glatten
Muskelzellen 60
1.2. Die Thrombin-induzierte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wird
durch die NADPH Oxidase vermittelt 61
1.3. Thrombin aktiviert MAP Kinasen und Proteinkinase B/Akt 63
1.4. Die Thrombin-induzierte Aktivierung der p38 MAP Kinase und
Proteinkinase B/Akt ist redox-sensitiv 64
1.5. Die NADPH Oxidase ist an der Thrombin-induzierten Aktivierung der p38 MAP
Kinase und Akt beteiligt 65
2. Die NADPH Oxidase vermittelt die Thrombin-induzierte VEGF und PAI-1
Expression: Rolle des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1 (HIF-1) 67
2.1. Thrombin stimuliert die Expression von VEGF und PAI-1 mRNA in glatten
Muskelzellen 67
2.2. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die NADPH Oxidase sind an der
Thrombin-stimulierten Expression von VEGF und PAI-1 mRNA beteiligt 68
2.3. Die p38 MAP Kinase und PI-3-Kinase sind an der Thombin-induzierten VEGF
und PAI-1 mRNA Expression beteiligt 69
2.4. Thrombin und Thrombozyten-assoziierte Wachstumsfaktoren induzieren die
HIF-1 a Proteinspiegel in humanen glatten Muskelzellen 72
2.5. Thrombin stimuliert die HIF-1 Aktivität 76
2.6. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)und die NADPH Oxidase sind an der
Regulation von HIF-1 a durch Thrombin beteiligt 79
2.7. Die p38 MAP Kinase und die PI-3-Kinase sind an der Regulation von HIF-1 a
durch Thrombin beteiligt 83
3. Thrombin induziert die Tissue Factor mRNA Expression und prokoagula-
torische Aktivität in glatten Muskelzellen: Rolle der NADPH Oxidase 82
3.1. Thrombin stimuliert die Tissue Factor mRNA Expression und prokoagulatorische
Oberflächenaktivität in humanen glatten Muskelzellen 85
3.2. Die Thrombin-induzierte Tissue Factor mRNA Expression und Tissue Factor-
abhängige prokoagulatorische Oberflächenaktivität sind redox-sensitiv 86
3.3. Die NADPH Oxidase ist an der Thrombin-induzierten Tissue Factor mRNA
3
Expression und prokoagulatorische Oberflächenaktivität beteiligt 88
3.4. p38 MAP Kinase und PI-3-Kinase sind an der Thrombin-induzierten
Tissue Factor mRNA Expression beteiligt 91
D. Diskussion 93
1. Die NADPH Oxidase spielt eine zentrale Rolle bei der Thrombin-induzierten
Aktivierung von p38 MAP Kinase und Proteinkinase B/Akt 93
1.1. Die NADPH Oxidase vermittelt die Thrombin-stimulierte Bildung von reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) 93
1.2. Die NADPH Oxidase reguliert die Thrombin-induzierte Aktivierung von p38 MAP
Kinase und Akt 94
2. Die NADPH Oxidase vermittelt die Thrombin-induzierte VEGF und PAI-1
mRNA Expression über die Aktivierung des Hypoxie-Induzierbaren
Faktors-1 (HIF-1) 97
2.1. Die NADPH Oxidase vermittelt die Thrombin-induzierte Aktivierung des Hypoxie-
induzierbaren Faktors-1 (HIF-1) 97
2.2. PI-3-Kinase/Akt und p38 MAP Kinase Signalweg spielen eine zentrale Rolle bei der
Induktion des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1 (HIF-1) durch Thrombin 100
2.3. Die NADPH Oxidase ist an der Thrombin-stimulierten Induktion von VEGF
und PAI-1 beteiligt 100
3. Die NADPH Oxidase spielt eine zentrale Rolle beim thrombogenen Zyklus 102
3.1. Thrombin induziert über die Bildung von Tissue Factor einen thrombogenen
Zyklus 102
3.2. Die NADPH Oxidase vermittelt die Thrombin-induzierte Tissue Factor Expression
und Aktivität 103
E. Zusammenfassunq/Summarv 107
F. Abkürzungsverzeichnis 111
G. Literaturverzeichnis 113
4
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