Nitrostyrolderivate als Apoptoseauslöser: strukturelle Anforderungen Mechanismus und Tumorselektivität
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2004
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
1.1 Apoptose 1
1.1.1 Allgemeines 2
1.1.2 Caspasen - zentrale Effektoren der Apoptose 3
1.1.3 Pro- und anti-apoptotische Regulatorproteine - Die Bcl-2-Familie 5
1.1.4 Extrinsische und intrinsische Auslösung des apoptotischen
Zelltodes 6
1.2 Resistenzmechanismen - Herausforderungen an die Chemotherapie 11
1.3 Gesteigerte Tumorselektivität durch Unterdrückung unerwünschter
Wirkungen der Zytostatikatherapie 13
1.3.1 Beispiele für organprotektive Substanzen 14
1.3.2 Amifostin als Zytoprotektivum des gesunden Gewebes 14
1.4 Ableitung der eigenen Aufgabenstellung 16
2 Material und Methoden 17
2.1 Zellkultur 17
2.2 Chemikalien und Testsubstanzen 19
2.3 Vitalitätsassay 23
2.4 Bestimmung der intrazellulären Glutathion-Konzentration 25
2.5 Westem-Blot-Analytik 26
2.6 Oxidation von Dihydrorhodamin 123 zu Rhodamin 28
2.7 Nitrit-Assay 29
2.8 Untersuchungen zur Änderung des Potentials der inneren
Mitochondrienmembran (A^m) mit dem Fluoreszenzfarbstoff JC-1 31
2.9 Bestimmung der DEVDase-Aktivität 32
2.10 DNA-Fragmentierung und Agarosegelelektrophorese 33
2.11 Statistische Datenauswertung 34
INHALTSVERZEICHNIS
3 Ergebnisse 35
3.1 Erfassung struktureller Anforderungen apoptoseauslösender
Nitrostyrolderivate 35
3.1.1 Charakterisierung der pharmakophoren Grundstruktur von
Asc-CI-NS 35
3.1.2 Zytotoxizität ausgewählter NS-Derivate und -Addukte 38
3.2 Protektion gesunder Zellen durch thiolische Agenzien und Amifostin -
Selektive Wirkung von NS-Derivaten in Tumorzellen 49
3.2.1 Screening von Thiolen und Thioethern auf ihr protektives Potential
gegenüber der NS-vermittelten Zytotoxizität 49
3.2.2 Verhinderung der NS-ausgelösten DEVDase-Aktivierung und DNA-
Fragmentierung durch Vorbehandlung mit NAC 50
3.2.3 Beeinflussung der zellulären GSH-Konzentration durch NAC 52
3.2.4 Zytotoxizität von NS- und DiNS-Addukten mit Cystein und NAC 53
3.2.5 Klinische Relevanz der tumorselektiven Protektion am Beispiel von
Amifostin und seinem Metaboliten WR 1065 54
3.3 Kinetische Studien zum Mechanismus der Apoptoseinduktion durch
NS-Derivate in GH3 Zellen 59
3.3.1 Oxidation von Dihydrorhodamin 123 als Marker für ROS und RNS 59
3.3.2 Zelluläre Nitritfreisetzung ins Kulturmedium 60
3.3.3 Aufhebung der NS-vermittelten Zytotoxizität und Nitritfreisetzung
durch Vorbehandlung mit dem Flavanoid Epicatechin 62
3.3.4 Aktivierung der c-Jun amino-terminalen Kinase 63
3.3.5 Untersuchungen zum mitochondrialen Membranpotential (A^) 64
3.3.6 Hypothese zum zeitlichen Verlauf der NS-vermittelten Apoptose 66
3.4 Wirkung von NS-Derivaten in GH3 Zellen mit MDR 1-Überexpression 67
3.4.1 Zytotoxizitätsdaten in GH3 OA100 Zellen im Vergleich zur
Ursprungzelllinie 67
3.4.2 DNA-Fragmentierung als Apoptosemarker in GH3 OA10o Zellen 68
4 Diskussion 69
5 Zusammenfassung 98
6 Literaturverzeichnis 100
Anhang 114
Abkürzungsverzeichnis 114
Abbildungsverzeichnis 117
Tabellenverzeichnis 119
Danksagung 12°
Selbständigkeitserklärung 121
ANHANG
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Morphologische Veränderungen während der Apoptose nach Kerr et
al. 1972. 3
Abb. 2: Caspasen - Aktivierung und Einteilung. 4
Abb. 3: Überblick der extrinsischen und intrinsischen Wege zur
Apoptoseauslösung (modifiziert nach Petak und Houghton, 2001). 7
Abb. 4: Strukturell verschiedene PP-lnhibitoren mit unterschiedlicher
Selektivität gegenüber PP1 und PP2A. 11
Abb. 5: Zelluläre Resistenzmechanismen nach Gottesman 2002. 12
Abb. 6: Zytoprotektive Substanzen in der Onkologie. 13
Abb. 7: Metabolisierung von Amifostin. 15
Abb. 8: Reduktion von MTTzu Formazan. 24
Abb. 9: Reaktion von Monochlorbiman mit Glutathion. 25
Abb. 10: Oxidation von DHR zu RH. 29
Abb. 11: Prinzip der Griess-Reaktion. 30
Abb. 12: Zytotoxizität von NS und seinen entsprechenden
Ascorbinsäureaddukten. 36
Abb. 13: DEVDase-Aktivität nach Behandlung mit Asc-NS, NS und CS im
Zeitverlauf. 37
Abb. 14: DNA-Fragmentierung nach Behandlung mit NS und
Ascorbinsäureaddukten. 38
Abb. 15: Zytotoxische Wirkung von NS-Addukten mit Pyrimidin und Pyridin im
Vergleich zu NS. 39
Abb. 16: Substitution des Benzenrings durch Furan und Indol. 40
Abb. 17: Modifikation an der NS-Kemstruktur. 41
Abb. 18: Rolle der Nitrogruppe in der ß-Position von Styrol. 42
Abb. 19: Vergleich der pro-apoptotischen Potenz von NS mit 2-, 3-, 4-DiNS. 43
Abb. 20: Caspase-3/7-Aktivierung nach Behandlung von GH3 Zellen mit NS
und mit DiNS-Derivaten. 44
Abb. 21: Auftragung der Hammett-Substitutionskonstanten gegen die
Restvitalität der NS-Derivate bei 10 uM. 45
Abb. 22: Auftragung der PP2A-Restaktivität- gegen LC50- Daten aus
GH3 Zellen. 46
Abb. 23: Auftragung der Hammett-Substitutionskonstanten gegen die IC50-
Daten ausgewählter NS-Derivate an der PP2A. 48
Abb. 24: Strukturen der verwendeten Thiole und Thioether. 49
Abb. 25: Schutz der NS-vermittelten Zytotoxizität durch Thiole, nicht aber
durch Thioether. 50
117
ANHANG
Abb. 26: Verhinderung der DEVDase-Aktivierung in GH3 Zellen nach
Behandlung mit NS, Asc-NS und Cys-NS durch Vorbehandlung mit
NAC. 51
Abb. 27: Verhinderung der NS-induzierten DNA-Fragmentierung durch
Vorbehandlung mit NAC oder WR 1065 52
Abb. 28: Zelluläre GSH-Konzentration nach NS-Behandlung mit und ohne
NAC-Vorbehandlung. 53
Abb. 29: Schematische Darstellung der Synthese von NAC- und
Cysteinaddukten mit NS und 2-DiNS. 53
Abb. 30: NAC- und Cysteinaddukte von NS und 2-DiNS wirken zytotoxisch. 54
Abb. 31: Protektion von GH3 Zellen nach Vorbehandlung mit NAC und
metabolisiertem Amifostin. 55
Abb. 32: Vergleich des morphologischen Erscheinungsbildes von GH3 Zellen
nach Behandlung mit NS und WR 1065. 56
Abb. 33: Zytotoxizität von Amifostin und WR 1065 in GH3 Zellen. 57
Abb. 34: Schutz der primären Rattenhepatozyten vor der Zytotoxizität von
NS-Derivaten durch Amifostin. 58
Abb. 35: Zelluläre DHR-Oxidation GH3 Zellen nach Behandlung mit NS,
2-DiNS und SIN-1. 60
Abb. 36: Zeitaufgelöste zelluläre Nitritfreisetzung von GH3 Zellen ins Medium
nach Behandlung mit NS, 2-DiNS und SIN-1. 61
Abb. 37: Vitalität von GH3 Zellen im MBA - Verhinderung der NS-Zytotoxizität
durch Epicatechin, nicht durch Vitamin E oder C. 62
Abb. 38: Zelluläre Nitritfreisetzung nach Vorbehandlung mit Epicatechin und
Behandlung mit NS oder 2-DiNS. 63
Abb. 39: Nachweis der JNK-Aktivierung im Western-Blot. 64
Abb. 40: JC-1-Färbung von GH3 Zellen nach ein und drei Stunden. 65
Abb. 41: Arbeitsmodell zur Apoptoseauslösung durch NS in GH3 Zellen. 66
Abb. 42: Zytotoxizität von NS und seinen Ascorbinsäureaddukten in GH3 und
GH3 OA100 Zellen. 67
Abb. 43: DNA-Fragmentierung in GH3 und in GH3 OA100 Zellen. 68
Abb. 44: Strukturformeln von Asc-CI-NS und der pharmakophoren Teilstruktur
NS. 70
Abb. 45: Bioisostere Ladungsverteilung an Nitro- und Carboxylgruppen. 75
Abb. 46: Übersicht reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffintermediate und deren
Reaktionen mit Glutathion. 83
Abb. 47: Chemische Reaktionen von NS. 94
Abb. 48: Hypothese zur konzertierten, pro-apoptotischen Wirkung von NS. 95
118
ANHANG
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Auswahl von Naturstoffen zur PP-lnhibierung nach McCIuskey et al.
2002. 10
Tab. 2: Testsubstanzen - Überblick Abkürzungen und Strukturformeln. 19
Tab. 3: Übersicht der Daten zur PP2A-Hemmung und zur Zytotoxizität der
Testsubstanzen. 47
119
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