Bedeutung der Rho-Proteine für die Aktivierung und Translokation der Protein-Kinase C in humanen Endothel- und Epithelzellen:
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2004
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Übersicht 1
1.2 Rho-Proteine 3
1.2.1 KLEINE GTP-BINDENDE PROTEINE 3
1.2.2 DIE SUBFAMILIE DER RHO-GTPASEN 3
1.2.3 RHO-PROTEINE UND INTRAZELLULÄRE SIGNALTRANSDUKTION 6
1.2.4 KLINISCHE BEDEUTUNG DER RHO-PROTEINE 7
1.2.5 RHO-INHIBITION DURCH BAKTERIELLE TOXINE 9
1.3 Clostridiale Toxine 9
1.3.1 CLOSTRIDIUM BOTULINUM-TOXJNE 10
1.3.2 CLOSTRIDIUM DIFFICILE-TOXJNE 10
1.3.2.1 Übersicht 10
1.3.2.2 Struktur 11
1.3.2.3 Wirkung 11
1.3.3 CLOSTRIDIUM SORDELLII-TOXINE 13
1.3.3.1 Übersicht 13
1.3.3.2 Struktur 13
1.3.3.3 Wirkung 13
1.4 Lipopolysaccharid (Endotoxin) 14
1.4.1 ÜBERSICHT 14
1.4.2 STRUKTUR UND WIRKUNGSMECHANISMUS 14
1.4.3 KLINISCHE BEDEUTUNG 17
1.5 Protein-Kinase C 18
1.5.1 ÜBERSICHT 18
1.5.2 STRUKTUR UND ENZYMATISCHE FUNKTION 18
1.5.3 AKTIVIERUNGSWEGE UND REGULATION DER PKC 21
1.5.4 REZEPTOR FÜR AKTIVIERTE C-KINASE (RACK) 23
Inhaltsverzeichnis II
1.5.5 KLINISCHE BEDEUTUNG DER PKC 24
1.5.5.1 Signaltransduktion über PKC in Endothel und Atemwegsepithel 24
1.5.5.2 PKCundLPS 25
1.6 Fragestellung 26
2. Material und Methoden 27
2.1 Materialien 27
2.1.1 REAGENZIEN UND ENZYME 27
2.1.2 ZELLKULTURMEDIEN 28
2.1.2.1 Herstellung der Kulturmedien . 28
2.1.2.2 Medium für PPAEC- / HUVEC-Isolation 28
2.1.2.3 PPAEC-Medium 28
2.1.2.4 HUVEC-Medium 28
2.1.2.5 BEAS-2B-Medium 28
2.1.3 PUFFER UND LÖSUNGEN 29
2.1.3.1 Allgemein 29
2.1.3.2 PKC-Assay 30
2.1.3.3 Western Blot 31
2.1.4 TOXINE 32
2.1.4.1 Clostridium difficile Toxin B-10463 32
2.1.4.2 Clostridium sordellii Lethal Toxin-1422 32
2.1.4.3 Lipopolysaccharid A (Endotoxin) 32
2.1.5 ZUBEHÖR 33
2.1.5.1 Verwendete Zellkulturmaterialien 33
2.1.5.2 Verwendete Materialien für PKC-Assay und Western Blot 33
2.1.6 SPEZIELLE GERÄTE 34
2.1.7 ANTIKÖRPER 34
2.1.7.1 Monoklonale Antikörper gegen PKC-Isoenzyme und RACK 34
2.1.7.2 Sonstige Antikörper 35
Inhaltsverzeichnis III
2.2 Methoden 35
2.2.1 ZELLEN UND ZELLKULTUR 35
2.2.1.1 Porcine pulmonalarterielle Endothelzellen (PPAEC) 35
2.2.1.1.1 Isolierung 35
2.2.1.1.2 Kultur 35
2.2.1.1.3 Charakterisierung 36
2.2.1.2 Humane Endothelzellen aus der Nabelschnur (HUVEC) 36
2.2.1.2.1 Isolierung 36
2.2.1.2.2 Kultur 37
2.2.1.2.3 Charakterisierung 37
2.2.1.3 Humane bronchiale Epithelzelllinie (BEAS-2B) 38
2.2.1.3.1 Kultur 38
2.2.2 PHOTOGRAPHISCHE DARSTELLUNG DER TOXINWIRKUNG 38
2.2.3 COLORIMETRISCHER PKC-ENZYM-ASSAY 39
2.2.3.1 Grundlagen der Methoden 39
2.2.3.2 Durchfuhrung des PKC-Enzym-Assays 40
2.2.4 WESTERN BLOT 42
2.2.4.1 Theoretischer Hintergrund der Methode 42
2.2.4.2 Durchfuhrung des Western Blots zum Nachweis des Protein-Kinase C-Isoenzym-
Profils in HUVEC-Zellen 44
2.2.4.3 Nachweis der PKCa-Translokation von der löslichen zur partikulären Fraktion 47
2.2.5 LAKTATDEHYDROGENASE-BESTIMMUNG 48
2.2.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG 49
3. Ergebnisse 50
3.1 Nachweis der Protein Kinase C-Isoenzyme in humanen Endothelzellen 50
3.2 Standardkurve für den Enzym-Assay 51
3.3 Lipopolysaccharid-induzierte PKC-Aktivierung in Endothelzellen 52
3.3.1 KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT DER LPS-WIRKUNG 52
3.3.2 ZEITABHÄNGIGKEIT DER ENDOTOXIN-WIRKUNG 53
Inhaltsverzeichnis IV
3.4 Wirkung großer clostridialer Toxine auf Endothelzellen 53
3.4.1 MORPHOLOGISCHE VERÄNDERUNGEN DURCH CLOSTRIDIUMDIFFICILE
TOXINB-10463 54
3.4.2 MORPHOLOGISCHE VERÄNDERUNGEN DURCH CLOSTRIDIUM SORDELLII
LETHALTOXIN-1422 54
3.5 Bedeutung großer clostridialer Toxine für die Protein-Kinase C-Aktivierung in
humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene 54
3.5.1 BEDEUTUNG VON CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOXINS B-10463 FÜR DIE
PKC-AKTIVIERUNG IN HUMANEN ENDOTHELZELLEN DER
NABELSCHNURVENE 55
3.5.1.1 Hemmung der Rho-Proteine blockiert LPS-induzierte Protein Kinase C-
Aktivierung in HUVEC 55
3.5.1.2 Hemmung der PMA-vermittelten Protein-Kinase C-Aktivierung durch Clostridium
difficile Toxin B-10463 induzierte Rho-Inhibition in HUVEC 56
3.5.2 EINFLUSS DES CLOSTRIDIUM SORDELLII LETHAL-TOXINS-1422 AUF DIE
PKC-AKTIVIERUNG IN HUVEC 58
3.5.2.1 Kein Effekt von Ras auf die PKC-Aktivierung durch Lipopolysaccharid in
HUVEC 58
3.5.2.2 Kein Einfluss von Clostridium sordellii Lethal Toxin-1422 auf die PMA-induzierte
Aktivierung der PKC in HUVEC 59
3.6 Einfluss von Clostridium difficile Toxin B-10463 auf die PKC-Aktivierung in
Schweine-Endothelzellen der Pulmonalarterie 60
3.6.1 INHIBITION DER ENDOTOXIN-INDUZIERTEN PKC-AKTIVIERUNG DURCH
CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOXIN B-10463 IN PPAEC 61
3.6.2 BLOCKIERUNG DER PMA-INDUZIERTEN PKC-AKTIVIERBARKEIT DURCH
HEMMUNG VON RHO MITTELS CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOXIN B-10463
IN PPAEC 62
3.7 Blockierung der PKC-Aktivierung in der humanen Bronchialepithel-Zelllinie
BEAS-2B durch Inhibition von Rho-Proteinen durch Clostridium difficile Toxin
B-10463 63
Inhaltsverzeichnis V
3.8 Einfluss von Clostridium difficile Toxin B-10463 auf die Protein-Kinase Ca-
Translokation 64
4. Diskussion 65
4.1 Die Lipopolysaccharid-vermittelte endotheliale Signaltransduktion und ihre
proinflammatorischen Effekte 65
4.2 Endotoxin und PKC-abhängige Signaltransduktionswege 66
4.3 Große Clostridiale Toxine als Werkzeuge zur Untersuchung der Rho-Proteine 68
4.4 Die Bedeutung von Rho-Proteinen für die Signaltransduktion durch die PKC 69
4.5 Direkte Interaktionsmechanismen von Rho Proteinen und PKC-Isoenzyme 70
4.5.1 DIREKTE MOLEKULARE INTERAKTIONEN ZWISCHEN PKC UND RHO-
PROTEINEN IN SÄUGETIERZELLEN 70
4.5.2 DIREKTE MOLEKULARE INTERAKTIONSMECHANISMEN ZWISCHEN
RHO-PROTEINEN UND DER PKC IN HEFEN 73
4.5.3 INTERAKTIONSMECHANISMEN ZWISCHEN RHO UND
UNTERSCHIEDLICHEN EFFEKTORPROTEINEN 74
4.5.4 MÖGLICHE MECHANISMEN DER INTERAKTION ZWISCHEN PKC UND
RHOA/CDC42 75
5. Zusammenfassung und Ausblick 76
6. Literaturverzeichnis 77
7. Anhang 102
7.1 Abkürzungsverzeichnis 102
7.2 Danksagung 104
Inhaltsverzeichnis VI
7.3 Lebenslauf 104
7.4 Erklärung an Eides Statt 107
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