Transfektion humaner Osteoblasten mit den Wachstumsfaktorgenen bFGF und VEGF als Ansatz des Tissue-Engineerings in der rekonstruktiven Chirurgie:
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Autor: Looden, Zarmina
Jahr: 2004
INHALTSVERZEICHNIS
Glossar verwendeter Abkürzungen 1
I. EINLEITUNG 2
1.1 Das Knochengewebe 2
1.2 Die Knochenregeneration 3
1.3 bFGF, ein zentraler Wachstumsfaktor zur Regulation
der Knochenbildung 4
1.4 VEGF, ein angiogener Wachstumsfaktor mit
vielfältigen Funktionen 7
1.5 Knochenregeneration durch Tissue Engineering
und Gentherapie 10
1.6 Konzept und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 12
II. MATERIALIEN UND METHODEN 14
2.1 Materialien 14
2.1.1 Reagenzien und Verbrauchsmaterial 14
2.1.2 Verwendete Puffer 14
2.1.3 Verwendete Plasmide 15
2.1.4 E. co/i-Stämme und Anzuchtbedingungen 15
2.1.5 Aufzuchtbedingungen und Zellmedien 15
2.2 Methoden 16
Molekularbiologische Methoden
2.2.1 Herstellung kompetenter E. coli 16
2.2.2 Transformation von E. coli 16
2.2.3 Isolation von DNA aus E. coli 16
2.2.4 Photometrische Bestimmung der Konzentration
und Reinheit der Plasmid-DNA 17
2.2.5 Lagerung der Plasmid-DNA 17
Proteinanalyse
2.2.6 Quantifizieren von Proteinen nach Bradford 18
2.2.7 Quantifizieren von Proteinen durch ELISAs 18
2.2.8 In vitro Transkription und Translation 19
Kultivierung der humanen Osteoblasten
2.2.9 Stabile Transfektion von Osteoblasten 19
2.2.10 Transfektion der Osteoblasten mittels liposomaler und
lipidbasierender Reagenzien 19
2.2.11 Retrovirale Transduktion der Osteoblasten 22
2.2.12 Luziferase Assay 22
2.2.13 X-Gal Färbung transduzierter Osteoblasten 23
2.2.14 Nachweis der Alkalischen Phosphatase im Zellysat 23
2.2.15 Zytochemischer Nachweis der Alkalischen Phosphatase 23
2.2.16 Immunhistochemische Osteocalcin Analyse 24
2.2.17 Statistische Analyse 24
III. ERGEBNISSE 25
Herstellung einer primären humanen Osteoblastenkultur aus
einer Spongiosabiopsie
3.1.1 Identifikation der Osteoblasten mittels Nachweis
der Alkalischen Phosphatase Aktivität 26
3.1.2 Identifikation der Osteoblasten durch eine
immunhistochemische Osteocalcin Analyse 27
Transfektion osteogener Zellen mit osteoinduktiven und
angiogenen Zielgenen
3.2.1 Vektorbeschreibung 28
3.2.2 Überprüfung der Vektoren durch einen Restriktionsverdau 30
3.2.3 Funktionelle Analyse der Vektoren mittels einer in vitro Translation 31
3.3.1 Transfektion humaner Osteoblastenkulturen
mit einem Luziferasereportergenkonstrukt 32
3.3.2 Transfektion der Osteoblasten mit pRPSFEN mittels
liposomaler und lipidbasierender Transfektionsreagenzien 36
3.3.3 Transfektion der Osteoblasten mit pCMX-VEGF165 mittels
liposomaler und lipidbasierender Transfektionsreagenzien 39
3.3.4 Retroviraler Gentransfer in der primären Osteoblastenkultur 42
3.3.5 Anreicherung transgener humaner Osteoblasten
nach Transfer von nackter Plasmid-DNÄ (pRPSFEN) 43
3.3.6 Zeitkinetik der Sezernierung der Transgenprodukte bFGF
und VEGF nach Transfektion humaner primärer Osteoblasten
mit pRPSFEN und pCMX-VEGF165 44
Bioassays
3.4 Proliferation humaner Osteoblasten und Endothelzellen
- Bioassays mit rekombinantem bFGF 50
3.5 Proliferation humaner Osteoblasten im Trennkammerversuch 53
3.5.1 Proliferation transgener Osteoblasten
in den Einsätzen der Trennkammer 56
3.5.2 Trennkammerversuch mit pCMX-VEGF165 transfizierten huOB 58
3.6 Transfektion und Einbettung der Osteoblasten
in eine Fibrinklebermatrix zur Herstellung
eines bioaktiven Gewebeersatzes 59
IV. DISKUSSION 63
4.1 Herstellung einer Osteoblastenkultur 63
4.2 Verknüpfung von Tissue Engineering und Gentherapie 64
4.3 Vorteile implantierter transgener Wirtszellen zu
rekombinanten Wirkstoffen 64
4.4 Methoden des Gentransfers 65
4.5 Bioassays 69
4.6 Biomaterialien 72
4.7 Ausblick auf weitere Experimente 73
V. ZUSAMMENFASSUNG 75
VI. LITERATURVERZEICHNIS 76
VII. DANKSAGUNGEN 88
VIII. CURRICULUM VITAE 90
IX. PUBLIKATIONEN UND PRÄSENTATIONEN 92
X. REFERENZEN 93
XI. ANHANG 94
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