Kristallstrukturen der O-Acetylserin-Sulfhydrylase CysM aus Escherichia coli, der humanen cytosolischen Thymidin-Kinase sowie eines Komplexes einer viralen Thymidin-Kinase:
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2004
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Autor: Claus, Michael Thomas
Jahr: 2004
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 O-Acetylserin-Sulfhydrylasen 1
1.1.1 Cystein-Biosynthese 2
1.1.2 O-Acetylserin-Sulfhydrylasen 4
1.1.3 Industrielle Aspekte 8
1.2 Thymidin-Kinasen 9
1.2.1 Herpesviridae 13
1.2.2 Therapeutische Anwendungen der Thymidin-Kinasen 14
1.3 Ziel der Arbeit 18
2 Materialien 19
2.1 Geräte 19
2.2 Chemikalien, Enzyme und Kits 21
2.3 Bakterienstämme und Plasmide 22
2.4 Nährmedien, Lösungen und Puffer 22
3 Methoden 26
3.1 Molekularbiologische Methoden 26
3.1.1 Ortsgerichtete Mutagenese 26
3.1.2 Präparation von Plasmid-DNA 27
3.1.3 Agarosegel-Elektrophorese 27
3.1.4 Kompetente Zellen und Transformation 28
3.2 Proteinchemische Methoden 28
3.2.1 Bakterienkultivierung und Zellaufschluss 28
3.2.2 Anionenaustauschchromatographie 29
3.2.3 Rekonstitution mit Pyridoxal-5 -phosphat 30
3.2.4 Gelpermeationschromatographie 30
3.2.5 Reinigung der SeMet-CysM 31
3.2.6 Bestimmung der Proteinkonzentration 32
3.2.7 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 33
3.3 Proteinkristalle 34
3.3.1 Kristallgitter und Kristallsymmetrie 34
3.3.2 Kristallisation von Proteinen 34
3.3.3 Lösungsmittelgehalt von Proteinkristallen 36
3.3.4 Kristallmontage 37
3.4 Röntgenographische Methoden 39
3.4.1 Röntgenstrahlung 39
3.4.2 Theorie der Röntgenstreuung 40
3.4.3 Reziproker Raum und Ewald-Konstruktion 43
3.4.4 Temperaturfaktoren 45
3.4.5 Fourier-Transformation und Phasenproblem 45
3.4.6 Kristallographische Datensammlung 46
3.4.7 Prozessierung und Datenreduktion 50
3.4.8 Lösung des Phasenproblems in der Kristallographie 52
3.4.9 Modellbau und Elektronendichtekarten 63
3.4.10 Verfeinerung des Modells 64
3.4.11 Verzwillingte Kristalle 68
3.5 Proteinstrukturen 71
3.5.1 Qualität von Proteinstrukturen 71
3.5.2 Darstellung von Proteinstrukturen 74
m
3.5.3 Proteinstrukturvergleiche 75
4 Ergebnisse und Diskussion zur CysM 76
4.1 Wildtyp der O-Acetylserin-Sulfhydrylase CysM 76
4.1.1 Gentechnische Methoden 76
4.1.2 Reinigung des Wildtyps 77
4.1.3 Kristallisation von CysMStrep und des Wildtyps 78
4.1.4 Röntgenographische Untersuchungen am CysM-Wildtyp 80
4.1.5 Molekularer Ersatz 82
4.1.6 Reinigung und Kristallisation der SeMet-CysM 83
4.1.7 Strukturlösung mittels multiwavelength anomalous diffraction (MAD) 84
4.1.8 Lokalisierung der Selen-Atome und Phasenbestimmung 85
4.1.9 Modellbau und Verfeinerung 86
4.2 Oberflächenmutanten der CysM 89
4.2.1 Planung der Mutanten 89
4.2.2 Kristallisation der Oberflächenmutanten 91
4.2.3 Datensammlung 92
4.2.4 Strukturlösung mittels Molekularen Ersatzes 93
4.2.5 Modellbau und Verfeinerung 94
4.2.6 Zwillingsverfeinerung 96
4.3 Validierung und Beschreibung der CysM-Strukturen 97
4.3.1 Validierung 97
4.3.2 Sekundärstruktur 106
4.3.3 PLP-Bindung 109
4.3.4 Dimerisierung 111
4.3.5 Kristallpackung 113
4.4 Vergleich der CysM-Strukturen mit anderen Enzymen 118
4.4.1 Gesamtstruktur 118
4.4.2 Aktives Zentrum 123
5 Ergebnisse und Diskussion zu den Thymidin-Kinasen......... 127
5.1 Humane Thymidin-Kinase 127
5.1.1 Strukturlösung 127
5.1.2 Modellbau und Verfeinerung 129
5.1.3 Validierung 129
5.1.4 Strukturbeschreibung der humanen Thymidin-Kinase 135
5.1.5 Kristallpackung 142
5.2 Vergleich der humanen Thymidin-Kinase mit Nukleotid-Kinasen 144
5.2.1 Sequenzvergleich 144
5.2.2 Strukturvergleich 144
5.2.3 Therapeutische Aspekte 151
5.3 Virale Thymidin-Kinase im Komplex mit (So«r/i)-Methanocarba-thymidin 153
5.3.1 Tränken und Datensammlung 153
5.3.2 Modellbau und Verfeinerung 153
5.3.3 Validierung 155
5.3.4 Vergleich mit anderen Komplexen der viralen Thymidin-Kinase 158
6 Zusammenfassung und Ausblick 160
7 Literaturverzeichnis..... ..... ....—.....—........—..... ...» ....— 162
Anhsnff ..... ¦..¦¦.¦¦¦.¦.....¦¦.¦•¦.....¦••••••••••¦¦¦•••••••••••¦•••••••174
Limit Dextrinase aus Hordeum vulgäre 174
Danksagung .... ... ..... ....................... ..... .... ... .181
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