Untersuchungen zur Prozessierung überlappender tRNA-Gene:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2004
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5
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
8
1
EINLEITUNG
.
10
1.1
MITOCHONDRIEN
.
10
1.2
TRANSFER-RNA
.
11
1.2.1
TRANSFER-RNA
UND
IHRE
AUFGABEN
IN
DER
PROTEINBIOSYNTHESE.
11
1.2.2
STRUKTURMERKMALE
VON
TRANSFER-RNAS
.
12
1.2.3
BIOGENESE
UND
PROZESSIERUNG
VON
TRANSFER-RNAS
.
14
1.2.3.1
DIE
REIFUNG
DES
5
'
-ENDES
.
14
1.2.3.2
DIE
GENERIERUNG
DES
3
'
-ENDES
.
15
1.2.3.3
SYNTHESE
UND
REPARATUR
DES
OBLIGATEN
CCA-TERMINUS.
16
1.2.3.4
PROZESSIERUNG
MITOCHONDRIELLERTRNA-VORLAEUFERTRANSKRIPTE
.
17
1.2.3.5
EDITING
MITOCHONDRIELLER
TRNAS
.
17
1.3
UEBERLAPPENDE
TRNA-GENE
IN
MITOCHONDRIEN
.
19
1.4
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
22
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
23
2.1
MATERIAL
.
23
2.1.1
FEINCHEMIKALIEN
.
23
2.1.2
ENZYME
.
23
2.1.3
PUFFER
.
23
2.1.4
NUKLEOTIDE
.
26
2.1.5
RADIOCHEMIKALIEN
.
26
2.1.6
OLIGONUKLEOTIDE
.
26
2.1.7
VEKTOREN
.
28
2.1.8
MEDIEN
.
28
2.1.9
BAKTERIENKULTUREN,
ZELLKULTUREN
UND
TIERMATERIAL
.
28
2.1.10
GERAETE
.
29
2.1.11
SONSTIGES
.
30
2.2
METHODEN
.
31
2.2.1
DNA-METHODEN
.
31
2.2.1.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
RNA
MITTELS
ABSORPTIONS
SPEKTROSKOPIE
.
31
2.2.1.2
REINIGUNG
UND
FAELLUNG
VON
DNA
UND
RNA
.
31
2.2.1.3 TRENNUNG
VON
DNA
MITTELS
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
31
2.2.1.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
31
2.2.1.4.1
AMPLIFIKATIONS-PCR
.
31
2.2.1.4.2
YYOVERLAP-EXTENSION
"
-PCR
.
32
2.2.1.5
IN
V/TRO-MUTAGENESE.
32
2.2.1.6
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
32
6
2.2.1.7
KLONIERUNG
VON
DNA
.
32
2.2.1.7.1
TA-KLONIERUNG
.
32
2.2.1.7.2
STANDARD-LIGATION
.
33
2.2.1.8
RESTRIKTIONSANALYSE
VON
DNA
.
33
2.2.1.9
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
33
2.2.2
RNA-METHODEN
.
33
2.2.2.1
TRENNUNG
VON
RNA
MITTELS
DENATURIERENDER
POLYACRYLAMID-GEL
ELEKTROPHORESE
.
33
2.2.2.2
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
POLYACRYLAMID-GELEN.
33
2.2.2.3
IN
V/TRO-TRANSKRIPTION.
34
2.2.2.4
AUTORADIOGRAFIE
.
34
2.2.2.5
IN
V/'TRO-PROZESSIERUNG:
M1-RNA
(RNASE
P)
.
34
2.2.2.6
IN
V/FRO-NUKLEOTID-EINBAU
IN
MT-TRNA
TYR
.
34
2.2.2.7
KLONIERUNG
VON
TRNAS
MIT
UNBEKANNTEN
3
'
-TERMINI
.
35
2.2.2.8 ZIRKULARISIERUNG
VON
TRNAS
.
35
2.2.2.9
PRAEPARATION
VON
TOTAL-RNA
AUS
E.
CO//-BAKTERIEN
.
35
2.2.2.10
PRAEPARATION
VON
TOTAL-RNA
AUS
S.
CEREVISIAE
.
36
2.2.3
PROTEIN-METHODEN
.
36
2.2.3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEIN
NACH
BRADFORD.
36
2.2.3.2
PRAEPARATION
VON
MITOCHONDRIEN
.
36
2.2.3.3 PRAEPARATION
MITOCHONDRIELLER
S100-EXTRAKTE
.
36
2.2.3.4
REINIGUNG
VON
UEBEREXPRIMIERTEN
PROTEINEN
AUS
E.
COLI.
37
2.2.3.4.1
6XHIS-TAG-FUSIONSPROTEINE
.
37
2.2.3.4.2 MALTOSE-BINDUNGS-PROTEIN
(MBP)-FUSIONSPROTEIN.
37
2.2.3.5 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
38
2.2.4
ZELL-METHODEN
.
38
2.2.4.1
KULTIVIERUNG
VON
E.
CO//-BAKTERIEN.
38
2.2.4.1.1
PLATTENKULTUR
.
38
2.2.4.1.2
FLUESSIGKULTUR
.
38
2.2.4.1.3
LAGERUNG
.
38
2.2.4.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
39
2.2.4.2.1
CHEMISCHE
METHODE
.
39
2.2.4.2.2
ELEKTROPORATION
.
39
2.2.4.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
40
2.2.4.4
UEBEREXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
NUKLEOTIDYLTRANSFERASEN
IN
E.
COLI
.
40
2.2.4.5
EXPRESSION
VON
TRNA-GENKONSTRUKTEN
IN
E.
COLI
CA244
.
40
2.2.4.6
KULTIVIERUNG
VON
S.
CEREVISIAE.
41
2.2.4.6.1
PLATTENKULTUR
.
41
2.2.4.6.2
FLUESSIGKULTUR
.
41
2.2.4.6.3
LAGERUNG
.
41
2.2.4.7
TRANSFEKTION
VON
S.
CEREVISIAE
.
41
2.2.4.8
EXPRESSION
VON
TRNA-GENKONSTRUKTEN
IN
S.
CEREVISIAE
.
42
3
ERGEBNISSE
.
43
3.1
ATP(:CTP)-TRNA-NUKLEOTIDYLTRANSFERASE
UND
3
'
-
EDITING
VON
TRNAS
.
43
3.1.1
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
TRNA-NUKLEOTIDYLTRANSFERASEN
.
44
7
3.1.2
AKTIVITAETSTEST
UND
UNTERSUCHUNG
DER
3
'
-EDITING-AKTIVITAET
RE
KOMBINANTER
TRNA-NUKLEOTIDYLTRANSFERASEN
.
44
3.2
UNTERSUCHUNG
EINES
ANDEREN
KANDIDATEN
FUER
DIE
EDITING
REAKTION
.
46
3.2.1
IDENTIFIZIERUNG
DES
CAD-PROTEINS
.
47
3.2.2
KLONIERUNG,
EXPRESSION
UND
AKTIVITAETSTEST
DES
CAD-PROTEINS.
49
3.3
ANALYSE
VON
TRNA-GENFUSIONEN
.
52
3.3.1
ETABLIERUNG
EINES
REPORTERSYSTEMS
IN
E.
COLI
.
53
3.3.2
EXPRESSION
UEBERLAPPENDER
BICISTRONISCHER
TRNA
GENE
.
58
3.3.2.1
EXPRESSION
IN
ESCHERICHIA
COLI
.58
3.3.2.2
EXPRESSION
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
63
4
DISKUSSION
.
66
4.1
UEBERLAPPENDE
TRNA-GENE
UND
EDITING
3
'
-SEITIG
VERKUERZTER
TRNAS
.
66
4.2
3
'
-EDITING
VON
TRNAS
DURCH
EINE
TRNA-NUKLEOTIDYL
TRANSFERASE?
.
69
4.2.1
3
'
-TRNA-EDITING:
IST
DIE
TRNA-NUKLEOTIDYLTRANSFERASE
BETEILIGT?69
4.2.2
DIE
TRNA-NUKLEOTIDYLTRANSFERASE
AUS
E.
COLI:
EINE
NEUE
(EDITING-)
AKTIVITAET?
.
71
4.2.3
DAS
CAD-PROTEIN
.
72
4.3
EXPRESSION
VON
UEBERLAPPENDEN
TRNA-GENFUSIONEN
.
75
4.3.1
ESCHERICHIA
COLI
.
75
4.3.1.1
PROZESSIERUNG
UND
EDITING
IN
VITRO
.
75
4.3.1.2
PROZESSIERUNG
IN
VIVO
.
76
4.3.1.3
DIE
3
'
-GELEGENE
RNA
WIRD
ABGEBAUT
.
78
4.3.1.4
REKONSTRUKTION
DER
PROZESSIERUNG
BICISTRONISCHER
VORLAEUFERTRANS
KRIPTE
IN
E.
COLI.
.
7Q
4.3.1.5
EIN
FUNKTIONALES
REPORTERSYSTEM?.
81
4.3.2
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
82
4.3.2.1
PROZESSIERUNG
EINES
BICISTRONISCHEN
VORLAEUFERTRANSKRIPTES
.
82
4.3.2.1.1
RNASE
P
ODERTRNASE
Z?
.
82
4.3.2.1.2
PROZESSIERUNG
DURCH
DAS
HDV-RIBOZYM.
83
4.3.2.2
EDITING
DER
SUPPRESSOR-TRNA
TYR
.
84
4.4
EVOLUTION
VON
TRNA-EDITING
.
87
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
91
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
93
DANKSAGUNG
.
102
LEBENSLAUF
.
104 |
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