DNA-analytische quantitative Tierartenbestimmung in Lebensmitteln am Beispiel verschiedener Nutztiere:
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| Format: | Buch |
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| Veröffentlicht: |
2004
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BEISPIEL VERSCHIEDENER NUTZTIERE VORGELEGT VON
DIPLOM-LEBENSMITTELCHEMIKERIN INES LAUBE VON DER FAKULTAET FUER
PROZESSWISSENSCHAFTEN DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET BERLIN ZUR ERLANGUNG
DES AKADEMISCHEN GRADES DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN - DR. RER. NAT. -
GENEHMIGTE DISSERTATION PRUEFUNGSAUSSCHUSS: VORSITZENDE: PROF. DR. RER.
NAT. A. HARTWIG . BERICHTER: PROF. DR. RER. NAT. LOTHAR W. KROH
BERICHTER: PROF. DR. RER. NAT. R. WITTKOWSKI TAG DER WISSENSCHAFTLICHEN
AUSSPRACHE: 10. JUNI 2004 BERLIN 2004 D83 INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS TABELLENVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VIII I EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1 II
GRUNDLAGEN 8 H.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 8 N.1.1 PRINZIP 8 N.1.2
KOMPONENTEN DES MASTERMIX 10 II. 1.3 TEMPERATURPROGRAMM 11 H.2 REAL TIME
PCR 11 H.2.1 TAQMAN*PCR-TECHNOLOGIE 12 11.2.1.1 PRINZIP 12 11.2.1.2 ABI
PRISM* 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM (7700 SDS) 13 UE.2.1.3 AUSWERTUNG
14 II.2.1.4 STANDARDS 16 N.2.2 LIGHTCYCLER-TECHNOLOGIE 17 11.2.2.1
PRINZIP 17 11.2.2.2 LIGHTCYCLER 18 11.2.2.3 SCHMELZKURVENANALYSE 19 IM
MATERIAL UND METHODEN 20 M.L MATERIAL 20 M.1.1 CHEMIKALIEN 20 III. 1.2
ENZYME, BAKTERIEN, VEKTOREN, ANTIBIOTIKA 21 III. 1.3 FERTIGREAGENZIEN 22
M.1.4 PRIMER UND SONDEN 23 III. 1.4.1 RIND-SPEZIFISCHE SYSTEME 23 III.
1.4.2 SCHWEIN-SPEZIFISCHES SYSTEM 23 III. 1.4.3 LAMM-SPEZIFISCHES SYSTEM
24 M. 1.4.4 ZIEGE-SPEZIFISCHES SYSTEM 24 III. 1.4.5 HUHN-SPEZIFISCHES
SYSTEM 24 III. 1.4.6 PUTE-SPEZIFISCHES SYSTEM 24 III.1.4.7
ENTE-SPEZIFISCHES SYSTEM 25 III. 1.4.8 SYSTEME ZUM NACHWEIS VON
SAEUGER-UND GEFLUEGELARTEN 25 III. 1.4.9 IPC-SYSTEM (INTERNAL POSITIVE
CONTROL) 25 M.1.4.10 VECTOR-SYSTEM 26 I INHALTSVERZEICHNIS M.1.4.11
BORDER-PRIMER 26 M.1.4.12 SYSTEM ZUM NACHWEIS VON MAIS (HUEBNER ETAL.
2001) 27 III. 1.5 UNTERSUCHUNGSMATERIAL 27 M.1.6 GERAETE 31 III. 1.7
VERBRAUCHSMATERIALIEN 31 HI.2 METHODEN 32 IUE.2.1 ERMITTLUNG DER
PCR-PRIMER-SONDEN-SYSTEME 32 III.2.1.1 LITERATUR-UND
SEQUENZDATENBANKRECHERCHE 32 M.2.1.2 BERECHNUNG DER
PCR-PRIMER-SONDEN-SYSTEME 32 III.2.2 HERSTELLUNG DER FLEISCH-UND
GEWEBEMISCHUNGEN 33 M.2.3 PROBENAUFARBEITUNG (DNA-PRAEPARATION) 33
M.2.3.1 ZELLLYSE UND DNA-EXTRAKTION 33 FFL.2.3.2 REINIGUNG DER DNA 34
M.2.3.3 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 34 111.2.4
POLYMERASE-KETTENREAKTION 35 111.2.4.1 MASTERMIX 35 111.2.4.2
TEMPERATURPROGRAMM 36 111.2.5 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 36 111.2.6
SEQUENZIERUNG 38 M.2.6.1 REINIGUNG DER PCR-PRODUKTE BZW. DER PLASMID-DNA
38 111.2.6.2 SEQUENZIERUNGS-REAKTION 38 M.2.6.3 FAELLUNG DER DNA 39
HI.2.6.4 KAPILLARELEKTROPHORESE 40 IH.2.7 TAQMAN* PCR-TECHNOLOGIE 41
M.2.7.1 MASTERMIX 41 M.2.7.2 MASTERMIX BEI VERWENDUNG DER,,
READY-TO-USE REACTION PLATE 42 111.2.7.3 EINSTELLUNGEN UND AUSWERTUNG
AM ABI PRISM* 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM (7700 SDS) 42 M.2.7.4
OPTIMIERUNG VERSCHIEDENER PARAMETER 43 III.2.7.5 QUANTIFIZIERUNG (VGL.
ABSCHNITT II.2.1.3) 44 IN.2.8 HERSTELLUNG VON PLASMID-STANDARDS
(TA-KLONIERUNG) 45 M.2.8.1 PCR, REINIGUNG DER PCR-PRODUKTE,
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 45 111.2.8.2 LIGATION MIT DEM PGEM*-TEASY
VECTOR SYSTEM 1 46 111.2.8.3 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN NACH
HANAHAN (1983; MODIFIZIERT) 46 M.2.8.4 TRANSFORMATION MITTELS
HITZESCHOCK 48 III.2.8.5 KULTIVIERUNG DER BAKTERIEN UND ISOLIERUNG DER
PLASMID-DNA (MINI-PRAEPARATION) 48 NI.2.8.6 LINEARISIERUNG DER PLASMIDE
DURCH RESTRIKTION 49 III.2.8.7 REINIGUNG UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 50
III.2.9 LIGHTCYCLER* TECHNOLOGIE 50 III.2.9.1 PROGRAMMIERUNG DER
ANALYSEDATEN 50 INHALTSVERZEICHNIS 111.2.9.2 MASTERMIX 51 111.2.9.3
START UND AUSWERTUNG DER ANALYSE 51 IV ERGEBNISSE 53 IV.L SUCHE NACH
GEEIGNETEN DNA-SEQUENZEN 53 IV.2 *BERECHNUNG DER
PCR-PRIMER-SONDEN-SYSTEME 57 IV.3 UEBERPRUEFUNG DER PRIMER UND BESTIMMUNG
DER OPTIMALEN ANNEALINGTEMPERATUR 60 IV.4 UEBERPRUEFUNG DER SPEZIFITAET DER
PRIMERSYSTEME.. 62 IV.5 ANWENDUNG DER TAQMAN* PCR-TECHNOLOGIE 63 IV.5.1
QUALITATIVE BESTIMMUNGEN 63 IV.5.1.1 OPTIMIERUNG DER PCR-BEDINGUNGEN 63
IV.5.1.2 UEBERPRUEFUNG DER SPEZIFITAET DER PRIMER-SONDEN-SYSTEME 67
IV.5.1.3 UNTERSUCHUNG UNTERSCHIEDLICHER RASSEN HINSICHTLICH IHRER
SEQUENZUEBEREINSTIMMUNG... 82 IV.5.1.4 BESTIMMUNG DER LOD, LOQ,
LINEARITAET, EFFIZIENZ UND WIEDERHOLBARKEIT 84 IV.5.2 QUANTITATIVE
BESTIMMUNGEN 87 IV.5.2.1 STANDARDS 87 IV.5.2.2 HERSTELLUNG VON
STANDARDREIHEN UND KONTROLLEN 90 IV.5.2.3 BESTIMMUNG DES ANTEILS DER
JEWEILIGEN TIERART IN DIVERSEN PROBEN 94 IV.5.2.4 UNTERSUCHUNG MOEGLICHER
EINFLUSSFAKTOREN AUF DIE RELATIVE QUANTIFIZIERUNG 96 IV.5.2.4.1
UNTERSUCHUNG UNTERSCHIEDLICH PROZESSIERTER FLEISCHPROBEN 96 IV.5.2.4.2
UNTERSUCHUNG UNTERSCHIEDLICHER GEWEBETYPEA 100 IV.5.2.4.3 BETRACHTUNG
DER GENOMGROESSEN UND DER DNA-KONZENTRATIONSUNTERSCHIEDE NACH EXTRAKTION
ZWISCHEN DEN EINZELNEN TIERARTEN 101 IV.6 ENTWICKLUNG DER *READY-TO-USE
REACTION PLATE 104 IV.6.1 DESIGN DER *READY-TO-USE REACTION PLATE 104
IV.6.2 BESTIMMUNG DER POSITIVKONTROLLE UND DER CUTOFF-KONTROLLE 105
IV.6.3 UNTERSUCHUNG VON PROBEN MIT HILFE DER *READY-TO-USE REACTION
PLATE 108 V DISKUSSION 111 V. 1 ENTWICKLUNG DER PRIMER-SONDEN-SYSTEME
111 V.2 UEBERPRUEFUNG DER PRIMERSYSTEME 113 V.3 UEBERPRUEFUNG DER
PRIMER-SONDEN-SYSTEME (QUALITATIV) 115 V.4 RELATIVE QUANTIFIZIERUNG DER
TIERARTEN MIT HILFE DER TAQMAN* TECHNOLOGIE 120 V.5 ENTWICKLUNG DER
*READY-TO-USE REACTION PLATE 128 V.6 ABSCHLIESSENDE ZUSAMMENFASSUNG UND
BEWERTUNG DER METHODE. 130 VI LITERATURVERZEICHNIS 133 M
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