Untersuchungen zum Promotorbereich und zum C-Terminus des humanen, Antidepressiva-sensitiven Noradrenalintransporters:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2004
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| adam_text | 3 Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
A Einleitung
1. Die noradrenerge Synapse 7
2. Genfamilie der Neurotransmitter-Transporter 11
3. Der Noradrenalin-Transporter (NAT) 14
4. Gestörte Neurotransmission bei der affektiven Psychose 20
5. Epidemiologie und genetische Komponenten der affektiven Psychose 22
6. Pharmakolherapie der affektiven Psychose : 23
B Zielsetzung 25
C Material und Methoden 27
1. Material 27
1.1. Chemikalien 27
1.2. Puffer und Lösungen 28
1.3. Verbrauchsmaterialien 30
1.4. Nährmedien für die Zellkultur 31
1.5. Nährmedien für die Bakterienkultur 32
1.6. Kits für die Molekularbiologie 33
1.7. Arbeitsgeräte 33
1.8. Computer-Software 35
1.9. Enzyme 35
1.10. Nukleinsäuren 35
1.10.1. Oligonukleotide 36
1.10.2. Vektoren 36
1.11. Bakterienstämme 41
1.12. Zelllinien 41
2. Methoden 43
2.1. Molekularbiologische Methoden 43
2.1.1. Isolierung von Plasmid-DNA 43
2.1 Ja. Plasmid Mini-Präparation mit dem „QiaPrep-Mini-Prep-Kit
(Qiagen) 43
2.1 Ib. Plasmid Mega-Präparation mit dem Qiagen „Plasmid Mega Kit 43
2.1.2. Konzentrationsbestimmung von DNA : 43
2.1.3. Agarose-Gelelektrophorese 44
2.1.4. Isolierung von DNA aus Agarosegelen 44
2.1.5. Reinigung und Fällung von DNA 45
2.1.5a. DNA-Extraktion mit Phenol/Chloroform 45
2.1.5.b Ethanolfällung von DNA 45
2.1.6. Klonierung von DNA 45
2.1.6.a. Klonierung von PCR-Fragmenten 45
2.1.6.b. Restriktionsverdau von DNA 46
2.1.6c. Ligation von DNA-Enden 46
2.1.6 d. Transformation kompetenter Bakterien 46
Inhaltsverzeichnis 4
47
2.1.7. Gerichtete in vJfro-Mutagenese
2.1.8. DNA-Sequenzierung ; g
2.1.9. Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaktion, PCR)
2.1.10 Luziferase-Reportergen-Assays mit dem Dual-Luziferase-Reporter
Assay - System (Promega) , N
2.1.11. Performance-Test des LUMAT LB 9507 mittels LUMItest-Basiskit (Brahms) 52
2.2. Pharmakologische Methoden
2.2.1. [3H]-Noradrenalin-Aufnahme
2.2.2 [3H]-Nisoxetin-Bindung *
2.3. Biochemische Methoden
2.3 1. Proteinbestimmung (nach Lowry et al. 1951) ^
2.4. Zellkulturmethoden
2.4.1. Mediumwechsel
2 4.2. Auftauen von Zellen
2.4.3. Einfrieren von Zellen
2.4.4. Teilen von Zellkulturen ^
2.4.5. Umsetzen von Zellkulturen 56
2 4 6 Aussäen von Zellen für Reportergen-Assays, [3H]-Nisoxetin-Bindungsversuche
und [3H]-Noradrenalin-Aufnahmeversuche
2 4 7. Polyornithinbeschichtung von Oberflächen (HEK293-Zellen) 57
2.4.8. Transiente Transfektion von Zellen
2.4.9. Stabile Transfektion von Zellen 59
2 4.10. Fluoreszenz-Mikroskopie
D Ergebnisse 61
1. Untersuchungen zum 5 -Bereich des hNAT-Gens °
11 Reportergenuntersuchungen zur Promotorregion des hNAT mit Hilfe des
Dual-Luziferase-Assays 61
1 2. Bedeutung des cAMP-Response-Elements (CRE) für die Genexpression 64
1.3. Charakterisierung des ersten Introns des KNAT-Gens im Luziferase Assay 67
2. Funktionelle Untersuchungen zum 3 -Bereich des hNAT-Gens 69
2 l.MutagenesedesExon-14 69
2 2 Plasmamembran-Expression der verschiedenen KNAT-Varianten 70
2 3 [3H]-Noradrenalin-Aufnahmeversuche 73
2.4. [3H]-Nisoxetin-Bindung 74
2.5. Bestimmung der Turnover -Zahl 75
E Diskussion 78
1. Charakterisierung des 5 -Bereichs des hNAT-Gens durch Reportergen-Assays 78
1.1. Analyse der hNAT-Promotorregion 78
12 Regulation der Genexpression durch das cAMP-Response-Elements (CRE) 80
13 Funktion des ersten Introns des hNAT-Gens 83
2. Bedeutung des C-terminal gelegenen Exon 14 für die Funktion des hNAT 85
2 1 Fluoreszenzmikroskopische Studien der hNAT-Varianten in pEGFP 85
2 2 Charakterisierung der Transporter-Lokalisation und Funktion mit Hilfe von [3H]NA-
Aufnahmeversuchen und [3H]NIS-Bindungsversuchen 86
5 Inhaltsverzeichnis
F Zusammenfassung 89
G Abkürzungen 92
H Literaturverzeichnis 96
I Anhang 110
J Danksagung 114
K Lebenslauf 115
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