Funktionelle Wirkung von HA14-1 auf Bcl-2,Bax-Wechselwirkungen und die Induktion von Apoptose in myeloisch-leukämischen Zellen:
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| Sprache: | German |
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2004
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| adam_text | Titel: Funktionelle Wirkung von HA14-1 auf Bcl-2,Bax-Wechselwirkungen und die Induktion von Apoptose in mye
Autor: Heiß, Peter
Jahr: 2004
Inhaltsverzeichnis
I ZUSAMMENFASSUNG 1
II EINLEITUNG 3
II.1 Tumorgenese 3
IL2 Der programmierte Zelltod 6
n.2.1 Todesrezeptor- und Granzym B-induzierte Apoptose 7
n.2.2 STREß-iNDUZffiRTE Apoptose und Proteine der bcl-2-Familie 8
n.2.3 Wechselwirkung zwischen Todesrezeptor- und Streu-induziertem Signalweg 12
n.2.4 Anti-apoptotisch wirkende Signalwege 13
11.3 AKUTE MYELOISCHE LEUKÄMIE 14
n.3.1 Bcl-2-ExpressionundZytostatikaresistenzen 16
n.3.2 Prognostische Bedeutung der Bcl-2- und Bax-Expression 16
n.3.3 Therapeutische Ansätze am Bcl-2-System 17
11.4 Das Molekül HA14-1 19
n.4.1 Identifikation von HA14-1 als Bcl-2-bindendes Molekül 19
n.4.2 Biochemische Eigenschaften 20
11.5 Fragestellung 21
m THEORETISCHE GRUNDLAGEN 22
IH.1 DURCHFLUßZYTOMETRISCHE FLUORESZENZANALYTIK 22
DI. 1.1 DAS DURCHFLUßZYTOMETER FACS CALIBUR 24
EI. 1.2 DAS DURCHFLUßZYTOMETER FACS VANTAGE 30
m.2 Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer 31
HL3 APOPTOSE-ASSAYS 38
ÜI.3.1 DEPOLARISATION DES MiTOCHONDRIENPOTENTIALS 38
m.3.2 Aktivierung von Caspasen 38
ül.3.3 Nachweis der DNA-Fragmentierung mit Propidiumiodid 39
ül.3.4 TryptanblaufärbungundViabilität 39
IV MATERIALUNDMETHODEN 40
rv.l Material und Geräte 40
IV.2 Untersuchte Zellen 42
IV.2.1 DIE ZELLINIEN HL-60, HL-60-Dox, HL-60/NEO UND HL-60/BCL-2 42
IV.2.2 Präparation und Kultivierung primärer AML-Zellen 42
IV.2.3 Inkubation mit HA14-1 und CDDO 43
IV.3 Fluoreszenz-Resonanz-Energbe-Transfer 44
IV.4 APOPTOSEASSAYS 47
IV.4.1 DEPOLARISATION DES MlTOCHONDRIENPOTENTIALS 47
IV.4.2 AKTIVIERUNG VON CASPASEN 48
IV.4.3 Nachweis der DNA-Fragmentierung mit Propidiumiodid 48
IV.4.4 TRYPTANBLAUFÄRBUNGUNDVIABILITÄT 49
rv.5 Statistische Datenauswertung 49
V ERGEBNISSE 50
V.l Bestimmung der Wirkung von HA14-1 auf Bcl-2/Bax-interaktionen mittels
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer 50
V.l.l Fixierung und Permeabilisierung der Zellen 51
V. 1.2 ANTIKÖRPERFÄRBUNG DER BCL-2- UND BAX-PROTEINE 52
V. 1.3 Sterische Bindungseigenschaften derBcl-2- und Bax-Antikörper 54
V.l.4 EXPRESSION VON BCL-2 UND BAX IN HL-60-UND HL-60-DOX-ZELLEN 55
V. 1.5 EINFLUß DER HA 14-1-INKUBATION AUF DIE EXPRESSION VON BCL-2 UND BAX 56
V.l.6 Ergebnisse derFluoreszenz-resonanz-Energie-Transfer-Versuche 56
V.2 HA14-1 INDUZIERT APOPTOSE IM MODELLSYSTEM DER HL-60-ZELLEN 61
V.2.1 HA 14-1 INDUZIERT DIE DEPOLARISATION DES MlTOCHONDRIENPOTENTIALS 61
V.2.2 HA14-1 induziert die Aktivierung von Caspasen 62
V.2.3 HA14-1 INDUZIERT DIE FRAGMENTIERUNG DERDNA 63
V.3 HA14-1 INDUZIERT APOPTOSE IN PRIMÄREN AML-ZELLEN 64
V.3.1 HA14-1 INDUZIERT DIE DEPOLARISATION DES MlTOCHONDRIENPOTENTIALS 64
V.3.2 HA14-1 INDUZIERT DIE AKTIVIERUNG VON CASPÄSEN 65
V.3.3 TRYPTANBLAUFÄRBUNGUNDVIABILITÄT 66
V.4 HA14-1 SENSIBILISIERT BCL-2-ÜBERXPRIMIERENDE HL-60-ZELLEN BEZÜGLICH DES
CHEMOTHERAPEUTIKUMS CDDO 67
VI DISKUSSSION 69
VL1 Hemmung von Bcl-2/Bax-Interaktionen durch HA14-1 69
VI.2 Induktion von Apoptose durch HA14-1 72
VI.3 Möglicher Wirkmechanismus von HA14-1 73
VI.4 HA14-1 ALS KOMBINATIONS-CHEMOTHERAPEUnKUM 74
VI.5 Bedeutung von HA14-1 für die Klinik 76
VI.6 Ausblick 77
VII SCHLUßFOLGERUNGEN 79
Vm LITERATURVERZEICHNIS 81
LX ANHANG 94
LX.1 Danksagung 94
LX.2 Lebenslauf 95
LXJ PUBLDXATIONSVERZEICHNIS 96
LX.4 Ehrenwörtliche Erklärung 97
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