Molekulare Analyse des Genexpressionsmusters eines stark und schwach invasiven Melanomzellklons:
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| Veröffentlicht: |
2004
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| adam_text | I.Einleitung 1
1.1 Entstehung von Melanomen . 1
1.1.1 Epidemiologie 1
1.1.2 Risikofaktoren , 2
1.1.3 Pathogenese „ 3
1.2 Klinische Merkmale 5
1.3 Therapie „ 8
1.4 Familiäre Melanome vs. sporadische Melanome ........... .......... 9
1.5 Molekulare Veränderungen in raetastasierten Melanomen..... 11
1.6 Mel Im Hi und Mel Im Si - Tochterzellklone von Mel Im 13
1.7 Arbeitsziel „ 14
II. Material und Methoden 15
11.1 Material 15
II.1.1 Puffer, Medien und Lösungen 15
IM.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 19
11.13 Geräte, Apparaturen, Zubehör 20
11.1.4 RT-Primer 21
11.1.5 Antikörper 23
11.1.6 Zellinien 23
11.2 Molekularbiologische Methoden 24
11.2.1 DNA- und RNA- Methoden 24
11.2.1.1 RNA-Isolierung 24
n.2.1.2 Quantifizierung der RNA-Menge 25
n.2.13 Gelelektrophorese 25
II.2.1J.1 DNA-Gele 25
II.2.13.2 RNA-Gele 26
11.2.2 cDNA-Array 26
II.2.2.1 Reinigung und Konzentration der RNA 27
D.2.2.2 Radioaktive Markierung der Gesamt- RNA mit (a-3!PJdATP 27
II.2.2J Säulenchromatographie (Reinigung der radioaktivmarkierten cDNA) 28
11.2.2.4 Hybridisierung der Arraymembranen 28
11.2.2.5 Visuelle und computerisierte Auswertung der Arrays 29
n.2.3 Bestätigung der Arrayergebnisse: Reverse Transkriptase (RT) Polymerase
Kettenreaktion (PCR) 29
n.23.1 Reverse Transkription (RT) -30
TI.23.2 Die (semiquantitative) Polymerase Kettenreaktion (PCR) 30
11.233 Die quantitative Polymerase Kettenreaktion (Real-time PCR) 31
11.2.4 Proteinchemische Methoden 33
IL2.4.1 Präparation von Zellysaten 33
ü.2.4.2 Proteinmengenbestimmung 33
n.2.43 SDS-PAGE-Gelektrophorese(SDS-PAGE) 34
ü.2.4.4 Westernblot 34
11.2.5 ZeUkultur „ „ .35
ü.2.5.1 Kultivierung von eukaryotischen Zellen 35
II.2.5.2 Invasionsassays in Boydenkammern 36
III. Ergebnisse 37
m.l Nachweis der Stabilität des Phänotyps der Zellinien 31
III.2 Auswertung der cDNA-Arrays 38
IH.3 Bestätigung des Arrays durch semiquantitative und quantitative PCR 40
III.4 Ergebnisse der Westernblots 49
IV. Diskussion 51
IV.l Die Bedeutung von Veränderungen des Genexpressionsmusters für Invasion und
Metastasierung 51
IV.2 Verminderte Expression von Zytoskelett- und Extrazellulärmatrixproteinen in
hochinvasiven Mel Im Hi Melanomzellen...... ...... „ 53
TV3 Verminderte Expression von Caspase-2, Cyclin-C, mda-ti, Rho-A, ERB-B2,
ELK, E2F-1, E2F-3, Pleiotropin, Semaphorin-3B, EMMPRIN, TRK-T3 und
IGF-1 in Mel Im Hi Zellen 55
IV.4 Verstärkte Expression von Jagged-2, STAT-1, t-PA, Phospholipase-Dl,
Interleukin-13, c-myc, CDK5-aktivator, RAD-1 und E-cadherin in Mel Im Hi 62
IV.5 Nicht differenziell exprimierte Gene „ 66
IV.6 Der Wnt-signalling pathway: verminderte Expression von Wnt-5a, Wnt-10b und
DisheveUed in Mel Im Hi Zellen 69
IV.7 Zusammenfassung „ 72
V.Literatur 74
VI. Anhang 96
VI.2 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen 96
VI.2 Abkürzungen 97
Anhang
VI Anhang
VI.l Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Abbildung 1-1: TNM-Klassifikation des Melanoms (1990) 8
Abbildung 1-2: Synopse der Genexpression in progredienten Melanomstadien 13
Abbildung 1-3: Kultivierte Melanomzellklone Mel Im Hi (A) und Mel Im Si (B) 14
Abbildung II-2.1: Exemplarische Abbildung einer Lightcycler-PCR am Beispiel von
Semaphorin-3B 32
Abbildung II-2.2: Schematische Zeichnung einer Boydenkammer 36
Abbildung III-1: Auszählung (Mittelwert) von jeweils 4 Filtern in 3 Versuchsansätzen 37
Abbildung III-2: Fotografische Abbildung der cDNA-Arrays von Mel Im Hi und Si 38
Abbildung III-3: Genexpression progredienter Melanomstadien im Vergleich mit
melanozytären Vorläuferläsionen 39
Abbildung III-4: Semiquanitative PCR Gelphotos von ß-Aktin, Caspase-2, Cyclin-C,
Tenascin-C, Interleukin-13 und EMMPRIN 41
Abbildung III-5: Expressionsmuster der beiden Zellklone in Array und quantitativer PCR
in Mel Im Hi verstärkt exprimierte Gene 42
Abbildung III-6: In Mel Im Hi vermindert exprimierte Gene 43
Abbildung III-7: In beiden Zellklonen gleichstark exprimierte Gene 44
Abbildung III-8: Exemplarische Darstellung der quanitativen RT-PCR Verläufe von
Jagged-2 und t-PA 45
Abbildung III-9: Exemplarische Darstellung der quanitativen RT-PCR Verläufe von STAT-
1 und Phospholipase-D 1 46
Abbildung III-10: Exemplarische Darstellung der quanitativen RT-PCR Verläufe von
Dishevelled und Vimentin 47
Abbildung III-11: Exemplarische Darstellung der quanitativen RT-PCR Verläufe von
Semaphorin-3B und Wnt-5a 48
Abbildung 111-12: Westemblots von Jagged-2 49
96
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