Evaluierung der Einsatzmöglichkeiten von Proteomics in der Pflanzenbiochemie:
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[2004]
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Publikationen V
Danksagung VII
Abkürzungen IX
Zusammenfassung XI
Inhaltsverzeichnis XV
1 Einleitung 1
1.1 Proteom und Proteomics 1
1.2 Proteomics - Die Methode 2
1.2.1 Die zweidimensionale Gelelektrophorese 2
1.2.2 Die Kombination von Elektrophorese und
Massenspektrometrie 3
1.2.3 MALDI-TOF und der Peptidmassen-Fingerabdruck 3
1.2.4 ESI-MS/MS und die De Novo-Sequenzierung 6
1.3 Ziel der Arbeit 10
1.3.1 Proteomics in der Pflanzenbiochemie 10
1.3.2 Untersuchungen von Zellkulturmedien 11
1.3.3 Proteomics von Membranproteinen 12
1.3.4 Proteomics von Bitter-und Süßlupinen 13
2 Material und Methoden 15
2.1 Material 15
2.1.1 Geräte, Chemikalien und Reagenzien 15
2.1.2 Zellkulturmedien 17
2.1.2.1 Produktionsmedium 6 17
2.1.2.2 Woody plant Medium 18
2.1.3 Pflanzen 19
2.1.3.1 Nicotiana tabacum 19
XV
Inhaltsverzeichnis
2.1.3.2 Lupinus albus 20
2.2 Methoden 19
2.2.1 Zellkultur 19
2.2.1.1 L. albus Suspensionskulturen 19
2.2.1.2 Tabak Wurzelkulturen 19
2.2.1.3 Flüssigkulturen von Zellaggregaten 20
2.2.2 Isolierung pflanzlicher Membranen und
Membranproteine 20
2.2.3 Isolierung intakter Chloroplasten 21
2.2.4 Zwei-Phasentrennung von Membranen 22
2.2.5 Chemische Analytik 23
2.2.5.1 Alkaloidisolierung 23
2.2.5.2 Kapillar Gas-Flüssig-Chromatographie 23
2.2.5.3 Massenspektrometrie 23
2.2.6 Elektrophoretische Trennverfahren 24
2.2.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 24
2.2.6.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese 24
2.2.6.3 Präparative isoelektrische Fokussierung 25
2.2.6.4. Kolloidale Coomassie Färbung 25
2.2.6.5 Silberfärbung 25
2.2.7 Chromatographische Trennverfahren 26
2.2.7.1 Gelfiltration 26
2.2.7.2 Concanavalin A-Affinitätschromatographie 26
2.2.7.3 DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie 23
2.2.8 Massenspektrometrie von Proteinen 27
2.2.8.1 Trypsinverdau im Gel 27
2.2.8.2 ESI-MS/MS 28
2.2.8.3 MALDI-TOF/TOF 28
2.2.9 Bestimmung der Proteinkonzentration 28
2.2.10 Enzymatische Untersuchungen 29
2.2.10.1 Hydrolasen 29
2.2.10.2 DNAsen 29
2.2.10.3 RNAsen 29
XVI
Inhaltsverzeichnis
2.2.10.4 Succinat-Dehydrogenase 30
2.2.10.5 NADPH/Cytochrom C Reduktase 30
2.2.10.6 ATPase 30
2.2.10.7 Protease 31
2.2.10.8 Chitinase 31
2.2.10.9 Alpha- Amylase 31
2.2.10.12 Peroxidase 32
2.2.11 Concanavalin A-Färbung der Plasmamembran 32
3 Ergebnisse und Diskussion 33
3.1 Untersuchung pflanzlicher Zellkulturmedien 3 3
3.1.1 Proteomics pflanzlicher Zellkulturrnedien 3 3
3.1.2 Proteincharakterisierung 37
3.1.3 Enzymatische Untersuchung der Zellkulturmedien 3 8
3.1.4 Diskussion 41
3.3 Proteomics pflanzlicher Membranproteine 45
3.3.1 Isolierung pflanzlicher Membranen und Membranproteine 45
3.3.2 Proteomics von integralen Membranproteinen 49
3.3.3 Proteomics peripherer Membranproteine 5 3
3.3.4 Diskussion 57
3.2 Proteomics von Bitter-und Süßlupinen 61
3.2.1 Vergleich der Expressionsprofile der Chloroplasten 61
3.2.2 Vergleich der Expressionsprofile ganzer Blätter 66
3.2.3 Diskussion 69
4 Ausblick 71
Literaturverzeichnis 72
Anhang . 84
XVII
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