Molekulargenetische Untersuchungen bei Kindern mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und Inversion 16:
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| Format: | Buch |
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| Veröffentlicht: |
2002
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Erklärung verwendeter Abkürzungen und Begriffe i
1 Einleitung 1
1.1 Chromosomale Translokationen bei malignen Tumoren 4
1.1.1 lnv16beiAML 8
1.2 Ras-Onkogene 11
1.2.1 Funktionsweise der Ras-Proteine 11
1.3 Biologische Funktion des NF1-Proteins 12
1.4 Ras-Onkogene und Carcinogenese 13
2 Problemstellung der Arbeit 15
3 Untersuchungsgegenstand und Methoden 16
3.1 Untersuchungsgegenstand 1*
3.1.1 Zellkultur 16
3.1.2 Patientenkollektiv 16
3.2 Methoden 18
3.2.1 Isolierung mononukleärer Zellen 18
3.2.2 RNA-Isolation 18
3.2.3 Reverse-Transkription 19
3.2.4 DNA-Isolierung 19
3.2.5 Polymerase-Ketten-Reaktion 21
32.6 Agarosegelelektrophorese 24
3.2.7 Präparation einzelsträngiger DNA mit Magnetic Beads 24
3.2.8 DNA-Sequenzierung 26
3.2.8.1 Sequenzierung mit Sequenase 2
3.2.8.2 Polyacrylamidgel-Elektrophorese 28
3.2.9 In vitro Synthese von hybrid-RNA 29
4 Ergebnisse 34
4.1 Leukämiezellinie 34
4.2 Amplifikation des Fusionsprodukts CBFß/MYHH 34
4.3 Untersuchungen auf Punktmutationen in RAS-Onkogenen und der GTPase-
Domäne des Neurofibromatose 1 Gens 37
4.4 Synthese chimärer hybrid-RNA 41
5 Diskussion 43
5.1 Methodische Aspekte 43
5.1.1 Generierung von hybrid-mRNA zum Einsatz in der diagnostischen RT-PCR 43
5.1.1.1 Auswahl der Hybrid-mRNA 43
5.1.2 Polymerase-Ketten-Reaktion 44
5.1.2J Multiplex RT-PCR 45
5.1.3 Sequenzierung der Patientenproben 46
5.1.3.1 Auswertung der Sequenzdaten 47
5.2 AML M4Eo 48
5.2.1 AML M4Eo und Inversion 16 49
5.3 Mutationsanalyse der RAS-Onkogene und des Neurofibromatose-1 Gen 50
6 Zusammenfassung 52
7 Literaturverzeichnis 54
8 Anhang 62
8.1 Oligonukleotide 62
8.2 Verwendete Puffer und Reagenzien 65
8.3 Spezialgeräte 66
9 Danksagung 67
10 Lebenslauf 68
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Prozentuale Verteilung der Tumorerkrankungen im Kindesalter 1
Abbildung 2: Mechanismen der Onkogen-Aktivierung 5
Abbildung 3: Wichtige Chromosomenabberationen bei der AML 6
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Inversion am Chromosom 16 9
Abbildung 5: Schematische Darstellung der CBF-Untereinheiten 10
Abbildung 6: Modell des Ras-Signalweges 13
Abbildung 7: Chromatogramm eines sequenzierten Fragments 27
Abbildung 8: Basensequenz eines sequenzierten Fragments 27
Abbildung 9: Synthese der Chimären hybrid-mRNA 33
Abbildung 10: Längenvergleich des Fusionsproduktes CBFß/MYH11 derZellinie
ME-1 mit dem Marker (M) 34
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Fusionstranskripte 35
Abbildung 12: Agarosegelelektrophorese: PCR-Produkt eines Typ A-
Fusionsprodukts und der ME-1-Zellinie 37
Abbildung 13: Agarosegelelektrophorese der NF1-Fragmente 38
Abbildung 14: Agarosegelelektrophorese der H-Ras-Fragmente 39
Abbildung 15: Sequenzierung der Patientenprobe Nr. 13 40
Abbildung 16: Wildtyp-Seqzenz 40
Abbildung 17: Agarosegelelektrophorese der Chimären DNA-Produkte 41
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: FAB-Klassifizierung der akuten myeloischen Leukämie 2
Tabelle 2: Wichtige Chromosomenabberationen bei akuten myeloischen Leukämien 7
Tabelle 3: Ras-Mutationen bei menschlichen Tumoren 14
Tabelle 4: Klinische Daten der Patienten 17
Tabelle 5: Übersicht der PCR-Ergebnisse mit AF4-Kontrolle 36
Tabelle 6: Ras- und ME-1 -Fragmente 38
Tabelle 7: Sequenzanalyse der RAS-Onkogene und der GAP-Domäne des
NF-1 Gens bei Kindern mit AML und M4Eo 39
Tabelle 8: Primersequenzen zur Amplifikation der RAS- und NF-Gen-Fragmente 62
Tabelle 9: Oligonukleotide zur Amplifikation der Fusionstranskripte Typ A+B 63
Tabelle 10: AF4-Primersequenzen 63
Tabellen: Primer zur Herstellung synthetischer mRNA-Hybride 64
Tabelle 12: T7 DNA-Polymerase 64
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