Immunmonitoring bei der Therapie der Multiplen Sklerose mit B-Interferonen: durchflusszytometrische Bestimmungen von Zytokinen und Zytokinrezeptoren
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Wettenberg
VVB Laufersweiler Verl.
2004
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Edition Scientifique
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Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Die Multiple Sklerose 1
1.2 Zytokine 13
1.2.1 Bedeutung von Zytokinen 13
1.2.2 Th1 und Th2 Zellen 14
1.2.3 Bedeutung der Zytokine IFN v, IL 4 und IL 10 bei der
Multiplen Sklerose 15
1.3 Immunmodulation durch IFN ß: vermutete Wirkmechanismen
bei der Multiplen Sklerose 23
1.4 Die Durchflusszytometrie zum Nachweis intrazellulärer Zytokine
und membranständiger Zytokinrezeptoren 28
1.5 Fragestellung 31
2 MATERIAL... 32
2.1 Chemikalien 32
2.2 Reagenzien für das Durchflusszytometer .32
2.3 Monoklonale Antikörper 33
2.4 Zellkulturmedium 34
2.5 Lösungen und Puffer 34
2.6 Geräte und sonstiges Material 36
2.7 Auswertungssoftware .37
2.8 Patientenkollektiv 38
3 METHODEN .41
3.1 Das Prinzip der Durchflusszytometrie. 41
3.2 Stimulationsassays für Leukozyten .47
3.2.1 Leukozytenstimulation mit verschiedenen Konzentrationen der
Stimulatoren PMA, lonomycin und Monensin 47
3.2.2 Leukozytenstimulation bei unterschiedlich langen
Stimulationszeiten .49
3.2.3 Einfluss des Antikoagulans auf die Leukozytenstimulation
und den intrazellulären Zytokinnachweis__ 50
3.2.4 Einfluss der Lagerung auf die Leukozytenstimulation
und den intrazellulären Zytokinnachweis 51
3.2.5 Kontrollzellen für die intrazelluläre Zytokinfärbung 51
3.3 Färbung der membranständigen Rezeptoren IFN R II
und IL 4R auf Leukozyten des peripheren Blutes. 52
3.4 Messparameter für die Patientenstudie 53
3.4.1 Bestimmung von IFN R II und IL 4R auf verschiedenen
Leukozytenpopulationen des peripheren Blutes. 54
3.4.2 Quantitative Bestimmung der Expression von IFN R II
undlL 4R 57
3.4.3 Intrazelluläre Markierung derZytokine IFN y, IL 4 und
IL 10 in Lymphozyten des peripheren Blutes. 59
3.4.4 Bestimmung der prozentualen Anteile der
Zytokin positiven Lymphozyten(sub)populationen 62
3.5 Überwachung des Durchflusszytometers. .63
3.6 Statistische Auswertung 64
4 ERGEBNISSE 66
4.1 Etablierung des intrazellulären Zytokinnachweises
mittels Durchflusszytometrie 66
4.1.1 Stimulatorenkonzentration 66
4.1.2 Stimulationsdauer 68
4.1.3 Antikoagulans 71
4.1.4 Lagerungszeit 73
4.2 Etablierung des durchflusszytometrischen Nachweises
der membranständigen Zytokinrezeptoren IFN R II und IL 4R .76
4.3 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, .78
ii
4.3.1 Positivkontrollzellen 78
4.3.2 Intra Sample , Intra und Inter Assay Präzision .81
4.4 Ergebnisse der Patientenstudie 85
4.4.1 Homogenitätsprüfungen 86
4.4.1.1 Strukturvergleich zwischen MS Patienten und Gesunden. 87
4.4.1.2 Strukturvergleich zwischen SPMS und RRMS Patienten. 90
4.4.1.3 Strukturvergleich zwischen untherapierten, IFN ß 1a [A]
und IFN ß 1a [R] therapierten MS Patienten mit RRMS ..92
4.4.2 Korrelationsüberprüfungen .97
4.4.2.1 Korrelation der Expression der immunologischen
Parameter mit Alter oder Geschlecht 97
4.4.2.2 Korrelation der Expression der immunologischen Parameter
mit dem klinischen Verlauf der MS Patienten 98
4.4.3 Ergebnisse der Longitudinalstudie (1). 100
4.4.3.11FN R Il Expression auf verschiedenen Leukozytenpopulationen 101
4.4.3.2 IL 4R Expression auf CD19+Zellen. 105
4.4.3.3 Intrazellulärer Nachweis von IFN y in T Zellen 106
4.4.3.4 Intrazellulärer Nachweis von IL 4 in T Zellen. 109
4.4.3.5 Intrazellulärer Nachweis von IL 10 in T Zellen. 110
4.4.4 Ergebnisse der Longitudinalstudie (2). 113
4.4.4.11FN R Il Expression auf verschiedenen Leukozytenpopulationen 113
4.4.4.2 IL 4R Expression auf CD19+Zellen. 117
4.4.4.3 Intrazellulärer Nachweis von IFN y, IL 4 und IL 10 in T Zellen 119
4.4.4.4 Korrelation der Expression der immunologischen Parameter
mit dem Auftreten von Nebenwirkungen oder vorliegender
Begleitmedikation 125
5 DISKUSSION _ 127
5.1 Etablierung der Durchflusszytometrie 127
5.2 Patientenstudie 134
5.2.1 Vergleich der Zytokin(rezeptoren)profile von Gesunden
und MS Patienten 135
in
5.2.2 Einfluss des klinischen Verlaufes auf die Zytokin(Rezeptoren)
Expression 137
5.2.3 Einfluss einer IFN ß Therapie auf die Zytokin(Rezeptoren)
Expression 139
5.2.4 IFN ß Präparatvergleich 143
5.3 MS und Veterinärmedizin _ __. 146
6 ZUSAMMENFASSUNG 149
7 SUMMARY 150
8 LITERATUR 151
9 ANHANG 179
10 DANKSAGUNG 212
IV
|
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