Transgene Tiermodelle des prímären Offenwinkelglaukoms:
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|---|---|
| adam_text | Abbildungsverzeichnis 7
Tabellenverzeichnis 8
Abkürzungsverzeichnis 9
1 Einleitung 11
1.1 Definition 11
1.2 Entstehung des Augeninnendrucks und Morphologie des Kammerwinkels . 11
1.3 Genetische Aspekte des primären Offenwinkelglaukoms (POWG) 13
1.3.1 Myocilin 14
1.3.2 Myocilin und seine Mutationen 19
1.4 Aufgabenstellung 20
2 Material und Methoden 23
2.1 Molekularbiologische Methoden 23
2.1.1 Plasmidisolierung aus E. coli 23
2.1.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 23
2.1.3 DNA-Reinigung 23
2.1.4 Isolierung von DNA aus Mäuseschwänzen 23
2.1.5 DNA-Sequenzanalyse 24
2.1.6 Herstellung kompetenter E. co//-Zellen 24
2.1.7 Transformation von E coli 24
2.1.8 Klonierung in TOPO-TA und TOPO-blunt 24
2.1.9 Western Blot 24
2.1.10 Dot Blot 25
2.1.11 RNA-Isolierung 26
2.1.12 Herstellung der cDNA (complementary DNA) 27
2.1.13 Amplifizierung von DNA-Fragmenten über Polymerase Ketten Re¬
aktion (PCR) 27
2.1.14 Herstellung der RNA-Sonden 28
2.1.15 Northern Blot 29
2.1.16 Southern Blot 31
2.2 Klonierung des Myocilin Überexpressionsplasmids 32
2.3 Klonierung des Myocilin mut Überexpressionsplasmids 33
2.4 Tiere und Tierhaltung 34
6 __^ 2.5 Kammerwasserentnahme und Präparation der Augen 34
2.6 Messungen des intraokulären Druckes an Mäusen 35
2.7 Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen 36
2.7.1 Eponeinbettung 36
2.7.2 Methacrylateinbettung mit Technovit 7100 36
2.7.3 Paraffineinbettung für die Immunhistochemie 37
2.7.4 In situ Hybridisierung (ISH) 37
3 Ergebnisse 39
3.1 Klonierung der Überexpressionsplasmide 39
3.2 Untersuchung der Myocilin Überexpressionslinien 39
3.2.1 Überprüfung der Integration des Myocilin Überexpressionskonstruk-
tes 39
3.2.2 Vergleich der Expressionsrate der transgenen Myocilin Konstrukte . 40
3.2.3 Western Blots zum Nachweis von Myocilin 42
3.2.4 Immunhistochemischer Nachweis des überexprimierten Myocilins . 43
3.2.5 Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen 45
3.2.6 Messungen des intraokulären Drucks 48
3.3 Untersuchung der mMYOC-Mauslinien 49
3.3.1 Überprüfung der Integration des mMYOC-Konstruktes 49
3.3.2 Die RNA Expression von mMYOC 49
3.3.3 Proteinanalyse von mMYOC 51
3.3.4 Struktur der Linse von mMYOC-Mäusen 52
4 Diskussion 55
4.1 Myocilin 55
4.2 Mutiertes Myocilin 58
5 Zusammenfassung 61
Literaturverzeichnis 65
7
Abbildungsverzeichnis
1 Schematische Darstellung des Trabekelwerkes und des Kammerwasser-
abflußsystems des menschlichen Auges 12
2 Aufbau von Myocilin mit möglichen funktioneilen Motiven und den bekann¬
ten Mutationen 15
3 In situ Hybridisierung von Myocilin im Trabekelwerk des Auges 17
4 Konstrukt ßB1-MYOC-Maus 33
5 Sequenzierung der eingeführten Punktmutation 33
6 Konstrukt ßB1-mMY0C-Maus 34
7 ÜberexpressionskonstrukteßB1-MYOCundßB1-mMYOC 39
8 Southern Blot von DNA aus ßB1-MYOC-Mäusen 40
9 Northern Blots, in situ Hybridisierung (ISH) und Western Blots zum Nach¬
weis des überexprimierten Myocilins 41
10 Vergleich der Proteinmenge von Myocilin im KW der transgenen Mäuse
mit verschiedenen KW-Proben aus dem Menschen 44
11 Immunhistochemische Darstellung von Myocilin im Auge normaler WT-
Tiere und ßB1-MYOC transgener Tiere 46
12 Licht- und elektronenmikroskopische Analyse der Gewebe des vorderen
Auges 47
13 Messung des IOD von ßB1-MYOC-Mäusen und WT-Tieren 48
14 Southern Blot von DNA aus ßB1-mMYOC-Mäusen 49
15 Northern und Western Blots zum Nachweis des transgen überexprimier¬
ten, mutierten Myocilins 50
16 Licht-, elektronenmikroskopische und immunhistochemische Analyse der
Linse von ßB1-mMYOC-Mäusen und WT-Tieren 53
17 Auflichtmikroskopie des Auges einer transgenen ßB1-mMYOC-Maus mit
Expression von mutiertem Myocilin und eines normalen WT-Tieres 54
8 Tabellenverzeichnis
1 Liste der identifizierten Genloci für das primäre Offenwinkelglaukom .... 14
2 Gesamtproteinmenge und normalisierte Werte von Myocilin im KW der
transgenen Mäuse und in verschiedener KW-Proben aus dem Menschen
im Dot Blot 26
3 Liste der im Northern- und Southern Blot verwendeten Primer für Sonden . 29
4 Primer zur Klonierung der MYOC-Maus 32
5 Liste der verwendeten Primärantikörper 37
6 Liste der verwendeten Sekundärantikörper und Fluoreszensfarbstoffe ... 38
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