Studien zur Gen-Expression und zum DNA-Bindungsverhalten der humanen Krab-Zinkfingerproteine Kox1 und Kox19:
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2004
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1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
Z
INKFINGERGENE
.
1
1.2
K
RAB
-Z
INKFINGERGENE
.
3
1.3
D
IE
Z
INKFINGERPROTEINE
K
OX
1
UND
K
OX
19
.
7
1.4
R
EGULATION
DER
T
RANSKRIPTION
.
8
1.5
DNA-P
ROTEIN
-I
NTERAKTION
.
8
1.6
SPEZIFISCHE
DNA-B
INDUNG
DURCH
Z
INKFINGERPROTEINE
.
9
1.7
P
OSTULAT
EINES
ZINKFINGERSPEZIFISCHEN
E
RKENNUNGSCODES
.
12
1.8
D
ESIGNERZINKFINGERPROTEINE
.
13
1.9
F
RAGESTELLUNG
.
14
1.10
V
ERLAUFSBESCHREIBUNG
.
15
2.
MATERIAL
UND
METHODENTEIL
.
17
2.1
F
IRMENVERZEICHNIS
.
17
2.2
M
ATERIAL
ALLGEMEIN
.
18
2.3
M
EDIEN
FUER
DIE
B
AKTERIENKULTUR
.
18
2.4
E.
COL/-K12-BAKTERIENSTAEMME
.
19
2.5
L
IGATION
UND
P
LASMIDKLONIERUNG
.
19
2.6
P
LASMIDE
.
20
2.6.1
PUC18
(MBIFERMENTAS)
.
20
2.6.2
PEGFP-N2
VEKTOR
(BD-BIOSIENCE
CLONTECH)
.
21
2.6.3
PTETO7-VEKTOR
.
22
2.6.4
PRSET-B
VEKTOR
(INVITROGEN)
.23
2.6.5
PGEM
T
VEKTOR
(PROMEGA)
.
23
2.7
T
RANSFORMATION
.
23
2.8
P
RAEPARATION
VON
P
LASMID
-DNA
.24
2.9
A
LKOHOL
-P
RAEZIPITATION
.
25
2.10
A
NIONEN
-A
USTAUSCHERSAEULEN
.
25
2.11
A
DSORPTION
AN
G
LASPARTIKEL
.
26
2.12
R
ESTRIKTIONSENDONUKLEOLYTISCHE
S
PALTUNG
.26
2.13
E
LEKTROPHORETISCHE
A
UFTRENNUNG
VON
DNA-F
RAGMENTEN
.
27
2.13.1
ANALYTISCHE
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
.
28
2.13.2
PRAEPARATIVE
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
.
.
28
2.14
DNA-L
AENGENSTANDARDS
.
28
2.15
P
ROTEINSTANDARD
.29
2.16
P
32
-M
ARKIERUNG
/
RANDOM
PRIME
-
V
ERFAHREN
.29
2.16.1
SOUTHERN-BLOT
HYBRIDISIERUNG
.
30
2.16.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
P
32
-MARKIERTEN
DNA-SONDEN
.
31
2.17
DNA-S
EQUENZANAL
Y
SE
.
31
2.17.1
SEQUENZREAKTION
UND
DETEKTION
.32
2.18
B
IOINFORMATISCHE
A
NALYSE
.
32
2.19
P
OLYMERASEKETTENREAKTION
.
34
2.20
P
RIMERDESIGN
.36
2.21
DNA-TRANSFEKTION
IN
EUKARYOTEN
ZELLEN
.
36
2.22
A
NTIKOERPERMARKIERUNG
VON
F
LAG
-E
PITOPEN
.37
2.23
A
NALYSE
DER
T
RANSFEKTION
.
38
2.23.1
GEN-ISOLIERUNG
UND
KLONIERUNG
VON
KOXL9
ZUM
EINSATZ
IN
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTEN
.
38
2.23.2
TRANSFEKTION
.
41
2.24
E
XPRESSION
UND
A
UFREINIGUNG
VON
Z
INKFINGER
-P
ROTEINEN
.42
2.24.1
PROTEIN-EXPRESSION
VON
VEKTORKONSTRUKTEN
.
43
2.24.2
HAMSTOFFEXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
YYINCLUSION
BODIES
"
.
44
2.25
P
ROTEINANALYSE
MITTELS
SDS-PAGE
.
45
2.26
Q
UANTITATIVE
P
ROTEINFAELLUNG
.
46
2.27
P
ROTEINBESTIMMUNG
NACH
B
RADFORD
.46
2.28
C
OMPUTERGESTUETZTE
R
ENATURIERUNG
VON
Z
INKFINGERPROTEINEN
.47
2.29
T
ARGET
D
ETECTION
A
SSAY
(TDA)
.48
2.29.1
STANDARDISIERUNG
DER
TDA-EXPERIMENTE
.
51
2.29.2
ERZEUGUNG
VON
DNA-PAC-KLON-FRAGMENTEN
FUER
EINEN
EINSATZ
IM
TDA
.
51
2.29.3
DESIGN
RANDOMISIERTER
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
EINEN
EINSATZ
IM
TDA
.52
2.29.4
DURCHFUEHRUNG
DER
TDA-EXPERIMENTE
FUER
KOXL9
UND
RANDOMISIERTE
OLIGONUKLEOTIDE
.53
2.29.5
DURCHFUEHRUNG
DER
TDA-EXPERIMENTEFUER
KOXL
UND
RANDOMISIERTE
OLIGONUKLEOTIDE.
.54
2.29.6
DURCHFUEHRUNG
DER
TDA-EXPERIMENTE
FUER
KOXL
UND
DNA-PAC-KLON-FRAGMENTE
.
54
2.29.
7
DURCHFUEHRUNG
DER
TDA-EXPERIMENTE
FUER
BSA-PROTEIN
UND
DNA-PAC-KLON
FRAGMENTE
.54
2.29.8
DURCHFUEHRUNG
DER
TDA-EXPERIMENTE
FUER
BSA-PROTEIN
UND
RANDOMISIERTE
OLIGONUKLEOTIDE
.
54
2.30
RT-PCR
.
54
2.30.1
COMPUTERGESTUETZTE
DETEKTION
UND
ANALYSE
.
54
2.30.2
DATENANALYSE
DER
TAQMAN-EXPERIMENTE
.
57
2.30.3
ENTWURF
EINES
TAQMAN-ASSAYS
.
57
2.30.4
DURCHFUEHRUNG
DES
TAQMAN-ASSAYS
.
58
3.
ERGEBNISTEIL
.
60
3.1
H
UMAN
B
ODY
S
CREENING
VON
K
OX
1
UND
K
OX
19
.60
3.2
IN
VIVO
G
EN
-E
XPRESSION
VON
K
OX
1
UND
K
OX
19
.
64
3.3
IN
VITRO
G
EN
-E
XPRESSION
VON
K
OX
1
UND
K
OX
19
.
68
3.4
TDA-E
XPERIMENTE
.
71
3.4.1
TDA
MIT
BSA-PROTEIN
UNDDNA-PAC-KLON-FRAGMENTEN
.
71
3.4.2
TDA
MIT
KOXL
UND
DNA-PAC-KLON-FRAGMENTEN
.
72
3.4.3
TDA
MIT
BSA-PROTEIN
UND
RANDOMISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
75
3.4.4
TDA
MIT
KOXL
UND
RANDOMISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
76
3.4.5
TDA
MIT
KOXL9
UND
RANDOMISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
77
3.5
B
IOINFORMATISCHE
A
NALYSE
DER
TDA-E
RGEBNISSE
.79
3.5.1
DATENANALYSE
DES
TD
AS
MIT
KOXL
UND
DNA-PAC-KLON-FRAGMENTEN
.
79
3.5.2
DATENANALYSE
DES
TD
AS
MIT
KOXL
UND
RANDOMISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
86
3.5.3
DATENANALYSE
DES
TDAS
MIT
KOXL9
UND
RANDOMISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
87
4.
DISKUSSION
.
92
4.1
U
NTERSUCHUNG
ZUR
G
EN
-E
XPRESSION
VON
K
OX
1
UND
K
OX
19
.
92
4.2
IN
VIVO
G
EN
-E
XPRESSION
VON
K
OX
1
UND
K
OX
19
.
95
4.3
IN
VITRO
G
EN
-E
XPRESSION
VON
K
OX
1
UND
K
OX
19
.
96
4.4
TDA-E
XPERIMENTE
.
98
4.4.1
ZIELVORGABE
JUR
DIE
TDA
-EXPERIMENTE
.
98
4.4.2
DURCHFUEHRUNG
DES
TD
AS
MIT
KOXL
UND
DNA-PAC-KLON-FRAGMENTEN
.98
4.4.3
STATISTISCHE
EINORDNUNG
DER
TDA-ERGEBNISSE
.
99
4.4.4
AUTOREGULATION
.
101
4.4.5
ANALYSE
DES
DNA-BINDUNGSVERHALTENS
ANDERER
KRAB-ZINKFINGERPROTEINE
.104
4.4.6
TDA-ERGEBNISSE
MIT
KOXL
UND
RANDOMISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.109
4.4.
7
ANALYSE
DER
THEORETISCHEN
KOXL-DNA-BINDUNGSSEQUENZ
.
107
4.4.8
TDA
MIT
KOXL
9
UND
RANDOMISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
110
4.4.9
TRIPLETT-ANALYSE
.
111
4.4.10
ANALYSE
DER
THEORETISCHEN
KOXL9-DNA-BINDUNGSSEQUENZ
.
113
4.4.11
BEDEUTUNG
DER
BINDUNG
VON
KOXL
AN
ALU-REPEATS
.
115
4.5
A
USBLICK
.
117
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
119
6.
ANHANG.
.
4
.
I
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
II
8.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
.
XII
9.
DANKSAGUNG
.
XV
10.
LEBENSLAUF
.
XVI
11.
SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG
.
XVII
12.
THESEN
XVIII |
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