Molekularbiologische Analyse einer veränderten Genexpression in zirkulierenden Leukozyten von Patienten mit Normaldruckglaukom:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2004
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 7
1 Einleitung 9
1.1 Die Risikofaktoren des Normaldruckglaukoms 9
1.1.1 Intraokularer Druck (IOD) 9
1.1.2 Vaskuläre Risikofaktoren 10
1.1.3 Genetische Risikofaktoren 11
1.1.3.1 Mutationen als qualitative genetische Risikofaktoren 11
1.1.3.2 Veränderte Genexpression 12
1.1.4 Weitere Risikofaktoren 12
1.2 Entstehungsmechanismus des Glaukomschadens 12
1.2.1 Apoptose 12
1.2.2 Vaskuläre Dysregulation 13
1.2.3 Reperfusionsschaden 14
1.2.4 Pathogenetisches Konzept beim Glaukom 15
2 Material 16
2.1 Bakterienstamm 16
2.2 Plasmide 16
2.2.1 pSPORTI 16
2.2.2 pUC18 17
2.3 Chemikalien 17
2.4 Medien zur Vermehrung von Bakterien 17
2.5 Allgemeine Puffer und Lösungen 18
2.6 Molekulargewichts-Standards 20
3 Methoden 21
3.1 Patienten-und Probandenkollektiv 21
3.2 Kultivierung von Bakterien 21
3.3 Isolierung geringer Mengen Plasmid-DNA 22
3.3.1 Schnelle Lyse 22
3.3.2 QIAwell96 Ultra Plasmid Kit 23
3.4 Isolierung großer Mengen Plasmid-DNA 24
3.4.1 QM/J/ter Plasmid-Kit 24
3.5 Fällungen 25
3.5.1 Ethanol-Fällung 25
3.5.2 Isopropanol-Fällung 25
3.6 Hydrolyse von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen 25
3.7 Agarose-Gelelektrophorese 26
3.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen 26
3.8.1 DNACIean™KH 26
3.9 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 27
3.10 Isolierung von intakten zirkulierenden Leukozyten 28
3.11 Isolierung von Gesamt-RNA aus Leukozyten mit dem RNAzol S^RNA-Kit 28
3.12 mRNA-lsolierung aus Gesamt-RNA (Micro-FastTrack™2.0 Kit) 29
3.13 Subtraktive Hybridisierung ( Gene Hunting ) 30
-6-
3.13.1 Konstruktion einer subtraktiven cDNA-Genbibliothek 30
3.13.2 Subtraktion zweier unterschiedlicher mRNA-Pools 31
3.13.3 Klonierung einer subtraktiven cDNA-Genbibliothek 34
3.13.4 Qualitätskontrolle subtraktiver cDNA-Genbibliotheken 34
3.13.5 Transformation subtraktiver Genbanken 35
3.13.6 Screening subtraktiver cDNA-Genbibliotheken 36
3.13.7 Sequenzierung der ausgewählten Passagierfragmente 36
3.13.8 Auswertung 37
3.14 Dot-Blot-Analyse 37
3.14.1 Vorbereitung der Dot-Blot-Apparatur 37
3.14.2 Vorbereitung der mRNA-Proben 38
3.14.3 Applikation der mRNA 38
3.14.4 Hybridisierung der Dot-Blot-Membranen und Detektion der
fluoresceinmarkierten Sonden 39
3.14.5 Auswertung der Hybridisierungsergebnisse 39
3.15 PCR-Experimente 40
3.15.1 cDNA-Erststrangsynthese für PCR-Ansätze 40
3.15.2 PCR-Amplifikation des XPGC-Gentranskriptes 40
3.15.3 PCR-Amplifikation des ß-Actin-Gentranskriptes 41
3.15.4 Auswertung der PCR-Analysen 42
4 Ergebnisse 43
5 Diskussion 50
5.1 Interpretation der Ergebnisse 50
5.2 Bedeutung der festgestellten Genexpressionsunterschiede 51
5.2.1 p53 ....51
5.2.2 NTP 52
I 5.2.3 20 S Proteasomen Untereinheit XAPC7 52
f 5.2.4 XPGC, Xeroderma pigmentosum-Gen der Gruppe C 53
5.2.5 Survivin 54
5.2.6 ABC-Transporter 54
6 Zusammenfassung 56
7 Literaturverzeichnis 57
Danksagung 63
Curriculum vitae 64
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