Analyse differentieller Genexpression in dermalen Fibroblasten bei Sklerodermie mittels RAP-PCR für Differential Display:
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2004
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ABKÜRZUNGEN 8
1 EINLEITUNG 10
1.1 Sklerodermie 10
1.1.1 Epidemiologie der Sklerodermie 10
1.1.2 Klassifizierung der Sklerodermie //
1.1.3 Klinik und Prognose 12
1.1.4 Pathomechanismen bei der Entstehung der Sklerodermie 13
1.1.4.1 Vaskuläre Komponente 13
1.1.4.2 Immunologische Mechanismen 14
1.1.4.3 Kollagenprodiktion 15
1.2 Zielsetzung 17
2 material 18
2.1 Verwendete Chemikalien 18
2.2 Verwendete PCR-Primer 20
2.3 Nährmedien und Platten 20
2.4 Verwendete Lösungen 21
2.5 Biochemische Analysesets 22
2.6 Geräte 23
2.7 Gebrauchsgegenstände 23
3 METHODEN 24
3.1 Patienten und Asservation des Gewebes 24
3.2 flbroblastenextraktion 25
3.3 Zellkultur 25
3.3.1 Einfrieren und Auflauen der Zellen 26
3.4 RNA-ISOLIERUNG 26
3.4.1 RNA-Konzentrationsbestimmung 27
3.5 RNA ARBITRARILY PRIMED POLYMERASE CHAIN REACTION (RAP-PCR) 27
5.5./ Reverse Transkription 27
3.5.2 Durchführung der RAP-PCR. 28
3.6 Herstellung des radioaktiv markierten Gröbenstandards 30
3.7 PAA-Gelelektrophorese 30
3.7.1 Identifikation differentiell exprimierter Banden und Elution 31
3.7.2 Reamplifikation. 31
3.8 SSCP-GEL (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) 32
3.S.1 Elution und Reamplifikation aus dem SSCP-Gel, weitere Aufreinigung 33
3.9 Klonierung der erhaltenen DNA-Fragmente 33
3.9.1 Selektion positiver Kolonien 34
3.9.2 Konzentrationsbestimmung und Kontrolle des Plasmids. 35
3.10 Sequenzierung 36
3.11 Homologievergleich mit bekannten Gensequenzen, Datenbanksuche 36
3.12 primerdesign und -herstellung 36
3.13 Bestätigung der differentiellen Expression 37
3.13.1 Semiquantitative 1SS-PCR 37
3.13.2 Reahime PCR mittels IJghtCycler® 39
3.14 Stimulationversuche mit PDGF und EGF 41
4 ERGEBNISSE 42
6
Inhaltsverzeichnis
4.1 Zellkultur 42
4.2 rna-isolierung 43
4.3 RAP-PCR 44
4.4 SSCP-GEL 45
4.5 Klonierung 46
4.6 Sequenzierung 47
4.7 Homologievergleich 47
4.8 Differentiell exprimierte Gene, Kandidatengene 50
4.8.1 Primerdesign 50
4.9 Bestätigung der differentiellen Expression mittels semiquantitativer RT-
PCR 51
4.9.1 Gremiin 51
4.9.2 Estrogen responsive finger Protein 52
4.9.3 Lysyloxidase 53
4.10 Stimulationsversuche 54
4.1 dl Gremiin Expression nach PDGFStimulation 54
4.10.2 Gremiin Expression nach EGFStimulation 55
5 diskussion 57
5.1 Diskussion der Methoden 57
5.1.1 Hautbiopsieentnahme und Fibroblastenextraktion bei Sklerodermie 57
5.1.2 RAP-PCR 57
5.1.3 Quantitative Verfahren 59
5.2 Differentiell exprimierte Gene 60
5.2.1 Kollagen und Fibronektin 60
5.2.2 Lysyloxidase 60
5.2.3 Gremiin Protein 61
5.2.4 Zink fingerprotein 147, estrogen responsivefinger protein (efp) 63
5.2.5 Cbl , 63
5.2.6 Zusammenfassung der weiteren isolierten Gene. 64
5.3 Expressionsunterschiede in den Suboruppen 64
5.3.1 Expressionsunterschiede zwischen involvierter und nicht involvierter Haut bei
Sklerodermiepatienten 64
5.3.2 Expressionsunterschiede zwischen dSSc undlSSc 65
6 ZUSAMMENFASSUNG 66
7 LITERATURVERZEICHNIS— 68
8 DANKSAGUNG 78
9 LEBENSLAUF 79
7
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