Vergleichende Untersuchungen zweier Primersysteme zur PCR-gestützten Analyse des hämatopoetischen Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation:
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2004
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Allogene Stammzelltransplantation 1
1.1.1 Historischer Überblick 1
1.1.2 Prinzip und Durchführung der Knochenmarktransplanta¬
tion und der peripheren Blutstammzelltransplantation 3
1.1.3 Einteilung und Spenderauswahl 5
1.1.4 Indikationen 5
1.1.5 Komplikationen 7
1.2 Chimärismusanalyse 9
1.2.1 Der Begriff Chimäre in der griechischen Mythologie
und in der Transplantationsmedizin 9
1.2.2 Einteilung des hämatopoetischen Chimärismusstatus 10
1.2.3 Der gemischte hämatopoetische Chimärismus nach
allogener Stammzelltransplantation und seine Aussage¬
fähigkeit bezüglich des Rezidivrisikos 12
1.2.4 Therapieoptionen bei drohendem Rezidiv 15
1.2.5 Rezidivüberwachung 16
1.2.6 Variable number of tandem repeats und Short tandem
repeats 20
1.2.7 DNA-Fingerprinting - der genetische Fingerabdruck 21
1.2.8 PCR (polymerase chain reaction, Polymerase-
Kettenreaktion) 22
1.3 Problemstellung 25
II Inhaltsverzeichnis
2 MATERIAL UND METHODIK 27
2.1 Patientenkollektiv 27
2.2 Materialien 31
2.2.1 Lösungen und Chemikalien 31
2.2.2 Arbeitsgeräte 32
2.2.3 Arbeits- und Verbrauchsmaterialien 33
2.3 Methodik 35
2.3.1 Probengewinnung 35
2.3.2 Reinigung von DNA aus Vollblut und Knochenmark 36
2.3.3 Aliquotierung der isolierten DNA 39
2.3.4 Photometrische Messung der Nukleinsäure-Konzentration 39
2.3.5 Polymerase-Kettenreaktion 39
2.3.5.1 Berechnung der DNA-Menge für den PCR-Ansatz 39
2.3.5.2 Ansatz der Nukleotidlösung 40
2.3.5.3 Auswahl der Primer für die PCR mittels Primertest 40
2.3.5.4 Pipettieranleitung für die PCR 41
2.3.5.5 Amplifikation der DNA im Thermocycler 45
2.3.6 Analyse der PCR-Produkte mittels Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (PAGE) 46
2.3.6.1 Herstellung von Polyacrylamidgelen (PAA-Gelen) 46
2.3.6.2 Gelelektrophorese 47
2.3.6.3 Färben der Polyacrylamid-Gele und digitale Aufzeichnung 49
2.3.6.4 Dekontamination der Ethidiumbromidlösungen 50
2.3.7 Standardverdünnungsreihen 50
2.3.7.1 Pipettieranleitung für Standardverdünnungsreihen 51
2.3.7.2 Erstellen von Standardkurven 53
Inhaltsverzeichnis III
3 ERGEBNISSE 55
3.1 Etablierung von 8 STR-Primern (Primer 14-21) 55
3.1.1 Ermittlung der Reaktionsbedingungen 55
3.1.1.1 Zyklenzahl 56
3.1.1.2 Annealingtemperatur 56
3.1.1.3 Ausgangs-DNA-Menge 59
3.1.1.4 Proben-Auftragsmenge 60
3.1.1.5 Polyacrylamidkonzentration 61
3.1.1.6 Gleichspannung 61
3.1.2 Arbeitstechnische Vereinfachung 62
3.2 Primertests 62
3.3 Standardverdünnungsreihen 71
3.4 Vergleichende Darstellung von Short tandem
repeats und Variable number of tandem repeats
bei der PCR-gestützten Charakterisierung des
hämatopoetischen Chimärismus von 21 Patienten
nach allogener Stammzelltransplantation 87
3.4.1 Vergleichende Chimärismusanalysen, bei denen die
Short tandem repeats einen gemischten Chimärismus
früher detektieren als die Variable number of tandem
repeats 87
3.4.2 Vergleichende Chimärismusanalysen, bei denen die
Short tandem repeats und die Variable number of
tandem repeats einen gemischten Chimärismus
zeitgleich detektieren 88
IV Inhaltsverzeichnis
3.4.3 Vergleichende Chimärismusanalysen, bei denen die
Variable number of tandem repeats einen gemischten
Chimärismus früher detektieren als die Short tandem
repeats 88
3.4.4 Quantifizierung 95
3.4.5 Dynamik 95
4 DISKUSSION 96
4.1 Reaktionsbedingungen der STR-Primer 96
4.2 Diskriminierbarkeit von Empfänger- und Spender¬
allelen durch 7 STR-Primer 100
4.3 Sensitivität der STR-PCR 102
4.4 Eichkurven ermöglichen eine quantitative
Chimärismusanalyse 105
4.5 Vergleichende Untersuchungen zu einem STR- und
einem VNTR-Primersystem 106
4.5.1 Ist die quantitative Abschätzung des Empfängeranteils
unter Verwendung von STR- und VNTR-Markern
vergleichbar? 106
4.5.2 Weist die STR-PCR eine wiederauftretende Empfänger-
hämatopoese früher, später oder zeitgleich nach im
Vergleich zur VNTR-PCR? 108
Inhaltsverzeichnis V
5 ZUSAMMENFASSUNG 110
6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 112
7 BEZUGSQUELLENVERZEICHNIS 116
8 LITERATURVERZEICHNIS 118
VI Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
1) Indikationen zur allogenen Stammzelltransplantation 6
2) Patientenkollektiv 28
3) PCR-Pipettieranleitung 41
4) Primercharakteristika der VNTR-Primer 3 - 7 (Teil I von ni) 42
Primercharakteristika der STR-Primer 14-18 (Teil n von III) 43
Primercharakteristika der STR-Primer 19-21 (Teil HI von ni) 44
5) Der Temperaturzyklus im Thermocycler 45
6) Die primerspezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl 45
7) Herstellung der Gelmasse für ein 8 %iges und ein 12 %iges
PAA-Gel 46
8) Das Pipettieren der Proben in die Geltaschen 48
9) Die primerspezifische, experimentell ermittelte Zyklenzahl 56
10) Die primerspezifische, experimentell ermittelte Annealing¬
temperatur 57
11) Die Reaktionsvariablen der STR-Primerpaare im Vergleich 58
12) Informationsgehalt der 7 STR-Primer für 55 Empfänger-/
Spender-Paare 66
13) Ergebnisse von 27 Standardverdünnungsreihen
Teil I von m 72
Teil II von III 73
Teil UI von HI 74
Abbildunqsverzeichnis VII
Abbildungsverzeichnis
1) Die Chimäre: etruskische Bronzeplastik aus Arezzo 10
2) Chimärismusanalyse des Patienten UPN 1135 mit
vollständigem Chimärismus 11
3) Chimärismusanalyse des Patienten UPN 1016 mit
zunehmendem gemischtem Chimärismus 11
4) Chimärismusanalyse des Patienten UPN 1118 mit
abnehmendem gemischtem Chimärismus 12
5) Chimärismusanalyse des Patienten UPN 1516 mit
autologer Rekonstitution 12
6) Auftrennung des Molekulargewichtsmarkers auf einem PAA-Gel 49
7) Pipettierschema zum Erstellen einer Standardverdünnungsreihe 52
8) Berechnung des Spender- und Empfängeranteils am
Gesamtlocus 53
9) Veränderung der Annealingtemperatur bei Patient UPN 1118 57
10) Veränderung der in die PCR eingesetzten DNA-Menge bei
Patient UPN 1350 60
11) Einfluß der Polyacrylamidkonzentration auf die Trennschärfe
bei Patient 1023 61
12) Einfluß der angelegten Gleichspannung auf die Trennschärfe
bei Patient 1023 61
13) Primertest von Patient UPN 1029 mit den Primern 14,15,16,
17,18, 20 und 21 63
14) Primertest von Patient UPN 1265 mit den Primern 14,15, 16,
17,18, 20 und 21 63
15) Primertest von Patient UPN 1018 mit den Primern 14,15,16,
17, 18, 20 und 21 64
16) Informationsgehalt der Primer 14-21 68
17) Standardverdünnungsreihe von Patient UPN 1103 75
yin Abbildungsverzeichnis
18) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1118 77
19) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1135 77
20) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1023 78
21) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1269 78
22) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1080 79
23) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1128 79
24) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1400 80
25) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1412 80
26) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1298 81
27) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1287 81
28) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1002 82
29) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1516 82
30) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1045 83
31) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1016 83
32) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1350 84
I
Abbildungsverzeichnis IX
33) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1073 84
34) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1094 85
35) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1471 85
36) Verdünnungsreihe und zugehörige Standardkurve von
Patient UPN 1499 86
37) Allelkonstellation und Posttransplantationsanalyse von
Patient UPN 1016 mit VNTR- und STR-PCR 89
38) Allelkonstellation und Posttransplantationsanalyse von
Patient UPN 1412 mit VNTR- und STR-PCR 90
39) Allelkonstellation und Posttransplantationsanalyse von
Patient UPN 1298 mit VNTR- und STR-PCR 91
40) Allelkonstellation und Posttransplantationsanalyse von
Patient UPN 1118 mit VNTR- und STR-PCR 92
41) Allelkonstellation und Posttransplantationsanalyse von
Patient UPN 1350 mit VNTR- und STR-PCR 93
42) Allelkonstellation und Posttransplantationsanalyse von
Patient UPN 1023 mit VNTR- und STR-PCR 94
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