Induktion von programmiertem Zelltod in "Nicotiana tabacum L." durch virale oder humane Bcl-2-Proteine und Identifizierung pflanzlicher Interaktionsproteine:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
M-Press
2004
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| Schriftenreihe: | Forum Biologie
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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| adam_text | Titel: Induktion von programmiertem Zelltod in Nicotiana tabacum L. durch virale oder humane Bcl-2 Proteine
Autor: Roth, Bernhard
Jahr: 2004
Inhaltsverzeichnis 9
1 EINLEITUNG 13
1.1 Geschichtliches 13
1.2 Programmierter Zelltod 15
1.2.1 Apoptose 16
.2.2 Nekrose 17
.2.3 PCD bei Pflanzen 17
.2.4 Mitochondrien und PCD 19
.2.5 Die Familie der Bcl-2 Proteine 20
.2.6 PCD bei viralen und bakteriellen Infektionen 23
.3 Epstein-Barr-Virus/ BHRF1 -Protein 25
.4 Pathogenabwehr in Pflanzen 26
.5 Ziele der Arbeit 29
2 MATERIAL 30
2.1 Chemikalien und Enzyme 30
2.2 „Kits 30
2.2.1 Plasmid Mini/Midi-Präparationen 30
2.2.2 DNA-Eluierung aus Agarosegelen 30
2.2.3 Aufreinigung von PCR-Produkten 30
2.2.4 Sequenzierung 30
2.2.5 Westernblot Detektierung 30
2.3 Protein-Molekulargewichtsstandard 31
2.3.1 Prestained Protein Marker 31
2.4 Biologische Materialien 31
2.4.1 Bakterienstämme 31
2.4.1.1 Escherichia coli Subcloning Efficiency™ DH5a (Invitrogen) 3!
2.4.1.2 Escherichia coli DB3.1 (Invitrogen) 31
2.4.1.3 Escherichia coli MM294 (Meselson und Yuan, 1968) 31
2.4.1.4 Agrobacterium tumefaciens L.BA4404 (Hoekema et al., 1983) 31
2.4.2 Hefestämme 32
2.4.2.1 HF7c 32
2.4.2.2 MaV2O3 32
2.4.3 Virusstämme 32
2.4.3.1 Tabakmosaikvirus (TMV) 32
2.4.4 Zellinien 32
2.4.4.1 Humane Tumorzellinie 32
2.4.5 Pflanzen 32
2.4.5.1 Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN bzw. nn 32
2.4.6 Antikörper 33
2.4.6.1 monoklonaler Antikörper gegen BHRF1 33
2.4.6.2 Antikörper gegen TMV-Hüllprotein 33
2.4.6.3 Antikörper gegen V5-Epitop 33
2.4.6.4 sekundärer Antikörper 33
2.4.7 Vektoren 33
2.4.7.1 pUC19(NEB) 33
2.4.72 pBIN19 35S[GUS] 33
2.4.7.3 pBinl9/PRIa[GUS] 34
2.4.7.4 pRK20I3 34
10 Inhaltsverzeichnis
2.4.7.5 pIZT/V5-His 34
2.4.7.6 pUC19[6xHis-Bax] 35
2.4.7.7 pcDNA3-HA [Bik] 35
2.4.7.8 pRK2013 35
2.4.7.9 pEGFP-Bcl-XL 35
2.4.7.10 pDONR221 35
2.4.7.11 pDEST22 und pDEST32 36
2.4.7.12 pGBT9 37
2.4.7.13 pAD-GAL4 37
2.4.8 Tabak cDNA-Bank 37
2.4.9 Oligonukleotide (Primer) 37
2.4.9.1 Oligonukleotide für Sequenzierung 37
2.4.9.2 Oligonukleotide für Klonierungen 37
2.4.9.3 Gateway-Primer 38
3 METHODEN 39
3.1 Molekularbiologische Standardmethoden 39
Arbeiten mit Bakterienkulturen 39
Anzucht von Bakterienkulturen 39
.2 Transformation von Escherichia coli nach inoue und Mitarbeiter (1990) 41
.3 Plasmidpräparation aus Bakterien 42
.4 Herstellung von Bakterienstammkulturen 43
3.1.
3.1.
3.1.
3.1.
3.1.
3.1.2 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
3.1.3 DNA-Ligation 43
3.1.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 44
3.1.5 DNA Sequenzierung 44
3.1.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 45
3.1.6.1 Standard PCR mit Taq DNA-Polymerase 45
3.1.6.2 „Proofreading PCR mit Elongase 46
3.1.6.3 Test der Transgenität transformierter Pflanzen 47
3.1.6.4 „Colony screen mittels PCR 47
3.1.7 „Gateway Cloning 48
3.1.7.1 Die BP-Reaktion 49
3.1.7.2 Die LR-Reaktion 51
3.1.7.3 Amplifizierung von Gateway Vektoren 52
3.1.8 DNA-Extraktion aus Raji-Zellen modifiziert nach Blin und Stafford, 1976 53
3.2 Analyse von Proteinen 54
3.2.1 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen über SDS-PAGE 54
3.2.2 Immunodetektierung von Proteinen („Westernblot ) 56
3.2.2.1 Proteintransfer 56
3.2.2.2 Immunodetektierung 57
3.3 Agrobacterium-vermittelte Transformation von N. tabacum L. 58
3.3.1 Konjugariver Transfer des binären Vektors pBIN 19 aus E. coli in
Agrobacterium tumefaciens („Triparental mating ) 58
3.3.2 Transformation von A. tumefaciens durch Elektroporation 59
3.3.2.1 Herstellung der elektrokompetenten Zellen 59
3.3.2.2 Elektroporation 60
3.3.3 Anzucht von sterilen Tabakpflanzen 60
3.3.4 Agrobacterium-vernüttelte Transformation von N. tabacum L. 61
3.4 Arbeiten mit Pflanzen 63
3.4.1 Pflanzenaufzucht und Kultur im Gewächshaus 63
Inhaltsverzeichnis 11
3.4.2 Isolierung genomischer DNA aus Blattmaterial 63
3.4.3 Isolierung von Proteinen aus Blattmaterial 64
3.4.3.1 Proteinextrakte aus geringen Mengen Blattmaterial 64
3.4.4 Inokulierung von Pflanzen mit TMV 65
3.4.5 DAB- bzw. Evans-Blue-Färbung 65
3.4.6 Extraktion von Salicylsäure (SA) aus Tabakblättern 65
3.4.6.1 Analyse freie SA 65
3.4.6.2 Analyse konjugierter SA 66
3.4.6.3 Herstellung SA-Standard 66
3.5 Arbeiten mit Hefe (S.cerevisiae) 66
3.5.1 Kultivierung von Hefe 66
3.5.2 Transformation von Hefe 68
3.5.2.1 Herstellung kompetenter Hefezellen 69
3.5.2.2 Transformation von Hefezellen 69
3.5.3 Das „Yeast Two Hybrid System 70
3.5.3.1 Großtransformation von Hefe zur Durchmusterung einer cDNA-Bank 71
3.5.3.2 Bestimmung der Transformationseffizienz 73
3.5.3.3 Piasmid-Präparation aus Hefezellen 73
3.5.3.4 Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen 74
3.5.3.5 Qualitative Tests einer Protein-Protein-Interaktion 75
3.5.3.6 Quantitativer Test auf Protein-Protein-Interaktion(CPRG) 76
3.6 Arbeiten mit Phytopathogenen 77
3.6.1 Kultivierung von Xanthomonaden 77
3.6.2 Kultivierung der verschiedenen Pilze 78
4 ERGEBNISSE 79
4.1 Klonierung Apoptose modulierender Gene 79
4.1.1 Amplifikation von BHRF1 und Subklonierung in pUC 19 79
4.1.2 Klonierung BHRFl-Deletionskonstrukte in plZT[V5-6xHis] 79
4.1.2.1 Herstellung pIZT[BHRFl FL-V5-6xHis] 80
4.1.2.2 HerstellungpIZT[BHRFI ohne TM-V5-6xHis] 80
4.1.2.3 Herstellung pIZT[BHRFl nur „BH3 -V5-6xHis] 80
4.1.3 KlonierungvonpBIN19/35S[BHRFl] 81
4.1.4 Klonierung pBinl9/35S [BRHFl-FL-V5-6xHis], [BRHF1 ohneTM-V5-
6xHis] bzw. [BRHFl-„BH3 -V5-6xHis] 81
4.1.5 Klonierung von pBinI9/PRIa[6xHis-BaxJ 82
4.2 Charakterisierung von Pflanzen mit dem Transgen Bax bzw. BHRF1 82
4.2.1 Auslösung von Zelltod durch das Transgen Bax in Tabak 82
4.2.1.1 Transgene Nicotiana tabacum var. Samsun NN mit pBIN/PR 1 a [Bax] 84
4.2.1.2 Transgene Nicotiana tabacum var. Samsun nn mit pBIN/PRla [Bax] 84
4.2.2 „Spontan auftretende Nekrosen bei Pflanzen mit dem Transgen BHRF1 84
4.2.2.1 Transgene Nicotiana tabacum var. Samsun NN mit pBIN/35S[BHRFl] 84
4.2.2.2 Iransgene Nicotiana tabacum var. Samsun nn mit pBIN/35S [BHRF1] 87
4.2.2.3 Transgene Nicotiana benthamiana L. mit pBIN/35S [BHRF1] 87
4.2.2.4 Transgene Tabakpflanzen mit BHRFl-Deletionskonstrukten 87
4.2.3 Nachweis BHRF1 Protein in transgenen Pflanzen 89
4.2.4 HiOj-Nachweis und „Evans Blue Färbung „spontan nekrotischer
Blattgewebe 92
4.2.5 Entwicklungsabhängige Bildung von Spontannekrosen 92
12 Inhaltsverzeichnis
4.3 Kreuzungen BHRFI/Bax-transgener Tabakpflanzen mit nahG-transgenen
Tabakpflanzen 95
4.3.1 PRla[Bax] x 35S[nahG]-transgene Tabakpflanzen 95
4.3.2 35S[BHRFl]x35S[nahG]-transgene Tabakpflanzen 96
4.3.3 Nachweis PRla-Protein und Salicylsäure in transgenen Tabakpflanzen 97
4.4 Infektion transgener Tabakpflanzen mit diversen Phytopathogenen 99
4.4.1 Infiltration BHRF1-transgener Tabakpflanzen mit Bakterien 101
4.4.2 Infektion BHRF1-transgener Tabakpflanzen mit Pilzen 101
4.4.3 Infektion transgener Tabakpflanzen mit Virus (TMV) 104
4.4.3.1 Bax-transgene Tabakpflanzen 105
4.4.3.2 BHRFl-transgene Tabakpflanzen 107
4.4.4 Analyse der Virusausbreitung (TMV) in transgenen Pflanzen 108
4.4.5 Salicylsäure- und PRla-Akkumulation transgener Pflanzen nach Infektion
mit TMV 110
4.5 Isolierung von Pflanzenproteinen, die mit viralem BHRF1 -Protein
INTERAGIEREN 114
4.5.1 „Yeast Two Hybrid Screen einer Tabak cDNA-Bank mit dem
Köderprotein BHRF 1 114
4.5.1.1 Herstellung Köderplasmid pGBT9 [FL-BHRFl-V5-6xHis] 114
4.5.1.2 Großtransformation von Hefe zur Durchmusterung einer cDNA-Bank 114
4.5.1.3 Charakterisierung der primär positiven c-DNA-Klone 115
4.5.2 Klonierung bestimmter cDNA-Klone in Gateway-Hefe-Vektoren 125
4.5.3 Herstellung BHRFl-Deletionskonstrukte in Gateway-expressionsvektoren 126
4.5.4 Etablierung positiver Kontrollen für das „Yeast Two Hybrid System 128
4.5.5 Test der Spezifität der Interaktion zwischen den gefundenen Proteinen
mit BHRF1 im Gateway Proquest „Two-Hybrid System 128
5 DISKUSSION 136
5.1 Expression von Bax und BHRF1 in transgenen Tabakpflanzen 136
5.2 Kreuzungen Bax/BHRFI-transgener Pflanzen mit nahG Pflanzen und
Messung von SA- bzw. PR1 a Akkumulation 141
5.3 Infektion transgener Pflanzen mit diversen Phytopathogenen 142
5.4 Identifizierung von Pflanzenproteinen die mit BHRF 1 interagieren 145
5.4.1 „Yeast Two Hybrid Screen einer Tabak cDNA-Bank 145
5.4.2 Qualitative und quantitative Bestimmung der Protein-Interaktion mit
BHRF1 Deletionskonstrukten 150
6 ZUSAMMENFASSUNG 152
7 ABKÜRZUNGEN 154
8 LITERATURVERZEICHNIS 157
9 PUBLIKATIONSLISTE 1«
10 LEBENSLAUF HS
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