Molekulare und biochemische Charakterisierung humaner peroxisomaler ABC-Transporter:
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Aachen
Shaker
2001
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Inhaltsverzeichnis
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
2. einleitung 3
2.1. Peroxisomen 3
Tabelle 1: Charakterisierung der Peraxüu 7
2.2. Perohsomalb Erkrankungen 10
2.3. ABC Transportbr 12
2.4. Thema der Arbeit 15
3. material und methoden 17
3.1. Materialien 17
3.1.1. Bakterienstämme 17
3.1.2. Säugetierzellinien 17
3.1.3. Kulturmedien 17
3.1.4. PAC Klone 17
3.1.5. Plasmide 18
3.1.6. Puffer. IS
3.1.7. Antikörper (AK) 20
3.1.8. Oligonukleotidprimer. 27
3.1.9. Bezugsquellenverzeichnis 24
3.2. Umgang mit Fibroblasten 25
3.2.1. Kultivierung von Fibroblastenzeüen 25
3.2.2. Anlegen von Fibroblasten Primärladturen aus Hautbiopsiat 25
3.2.3. Immunflioreszenzflrbung von Fibroblasten 26
3.3. Umgang mit Bakterienzellen 26
3.3.1. Kultivierung von Escherichia coli 26
3.3.2. Transformation 27
3.3.3. Ãberproduktion von Fusionsproteinen 28
3.4. Präparattve Methoden 28
3.4.1. Isolierung von Plasmiden 28
3.4.2. Extraktion von genomischer DNA 28
3.4.3. Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen. 29
3.4.4. PAC Praparation 29
3.4.5. Isolierung zellulärer Membranen mit Natriumcarbonal 30
3.4.6. Isolierung und Aufreinigung von Fusionsproteinen 30
3.5. Quautäts und Quantttätsbestimmung von DNA 31
3.6. Enzymatische Reaktionen 32
3.6.1. Reslriktionsverdau 32
3.6.2. Polymerase Ketlenreaktion (PCR) 32
3.6.3. Sequenzierung 35
3.6.4. Ugation 37
3.7. Gelelektrophoretische Methoden 38
3.7.1. Agarosegelelektrophorese zur Trennung von DNA Fragmenten 38
3.7.2. Sequenziergele 38
3.7.3. SDS Potyacrylamid GelelektTophorese (SDS PACE) zur Abtrennung von Proteinen. 39
3.8. Transfer von Nukleinsäuren auf Nylonmembran (Southern Blot) 40
3.9. Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose oder PolyvwyudenfluoridKPVDF ) Membran
(Western Blot) 40
I
3.9.1. Transfer auf Nitrocellulose 40
3.9.2. Transfer aufPVDF Membran 41
3.10. Radioaktive Hybridisierung 41
3.10.1. Hybridisierung von DNA mit [a "P] dCTP markienen Sonden. 41
3.10.2. Oligonukleolidmarkierung mil [y "P] dATP 42
3.11. nicht radio aktiver nachweis von proteinen durch hrp markierte sekundäre antikörper
(Immunfärbung) 42
3.12. Proteinbestimmuno 43
3.13. kovalentes markieren von fusionsproteinen mit [032p] 8 azido nukleotiden 44
3.14. atp/gtpase aknvrtätsbestimmung 44
4. ERGEBNISSE 45
4.1. Molekulare Charakterisierung der PXMPI Genstruktur 45
4.1.1. Screening und Ãberprüfung von PAC Klonen 45
4.1.2. Ermittlung der PXMPl lntronlängen 46
4.1.3. Nachweis PXMP1 spezifischer PCR Banden durch Southern Blolling und radioaktive
Hybridisierung 47
Tabelle 2: Exon Struktur des humanen 70 kDa peroxisomalen Membranprotein Gens (PXMP1) (Gärtner
et al, 1998a) 48
4.2. Nachweis von ALD Prothnexpression in Fibroblastenzellen 49
4.3. KONSTRUKTE DER NUKLEOTIDBINDUNGSREGIONEN DES ALD GENS UND DES PXMP1 GENS 50
4.3.1. WUdtyp Konstrukte 50
4.3.2. Mutagenese Konstrukte 50
4.3.3. Transformation und Kontrolle der Wildtyp und Mutagenese Konstrukte 50
4.4. überexpression der fusionsproteine 52
4.5. Isolierung und Aufreinigung der Fusionsproteine 53
4.5.1. Zellyse undAmylose Affinitäts Chromatographie 53
4.5.2. lonenaustausch Chromatographie 55
Tabelle 3: Aufrcinigung der Fusionsproteine 58
4.6. Charakterisierung der Fusionsproteine 58
4.6.1. Western Blots 58
4.6.2. Photoaffinitatsmarkurung mit 8 azido [fP] ATP und 8 azido lfPl GTP 60
4.6.3. ATPase Ahivitätsmessimgen 61
Tabelle 4: Kinetische Parameter derATPase Aktivität der MBP NBF Fusionsproteine 63
5. DISKUSSION «5
5.1.ermntlungderlntronlängendespxmpl gens 65
5.2. Nachweis von ALD Proteinexpression in Fibroblasten eines Patienten mit der Mutation
S606L im ALD Gen 66
5.3. Konstruktion der Nukleotidbindunosfalten des ALD und des PXMPI Gens 66
5.4 überexpression der fusionsproteine 67
5.5 Isolierung und Aufreinigung der Fusionsproteine 68
5.6. Charakterisierung der Fusionsproteine 69
5.6.1. Western Blots 69
5.6.2. Interaktionen der Fusionsproteine mit Nukleotiden "
Tabelle 5: Vergleich der kinetischen Eigenschaften von ABC Transportem 7I
6. LITERATUR 75
7. ABKÃRZUNGSVERZEICHNIS "
8. DANKSAGUNG "
II |
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