Aufnahme von nicht glycosyliertem Procathepsin S-N104Q in humane embryonale Nierenzellen und intrazelluläre Sortierung:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2004
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
3
2.1.
ENDOSOMALE
UND
LYSOSOMALE
KOMPARTIMENTE
3
2.2.
SYNTHESE
UND
SORTIERUNG
LYSOSOMALER
ENZYME
8
2.3.
BEDEUTUNG
LYSOSOMALER
ENZYME
11
2.4.
AUFBAU
UND
FUNKTION
VON
CATHEPSIN
S
13
2.5.
ALTERNATIVE
SORTIERUNG
VON
LYSOSOMALEN
ENZYMEN
15
2.6.
ZIELSTELLUNG
DER
ARBEIT
18
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
19
3.1.
CHEMIKALIEN
19
3.2.
PUFFER
20
3.2.1.
PHOSPHAT-GEPUFFERTE
NATRIUMCHLORID-LOESUNG
(PBS)
20
3.2.2.
PUFFER
A
20
3.2.3.
IMIDAZOL-SACCHAROSE-PUFFER
20
3.2.4.
HOMOGENISIERUNGSPUFFER
21
3.2.5.
SDS-ELEKTROPHORESE-PROBENPUFFER
(5FACH)
21
3.2.6.
SDS-ELEKTROPHORESE-PUFFER
21
3.3.
ZELL-LINIEN
UND
ZELLKULTIVIERUNG
21
3.3.1.
ZELL-LINIEN
21
3.3.2.
KULTIVIERUNG
UND
PASSAGIERUNG
22
3.4.
HERSTELLUNG
UND
MARKIERUNG
VON
PROCATHEPSIN
S,
PROCATHEPSIN
S-N104Q
UND
CATHEPSIN
S
22
3.4.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
MIT
[
35
S]METHIONIN
22
3.4.2.
MARKIERUNG
DURCH
BIOTINYLIERUNG
25
3.4.2.L.BIOTINYLIERUNG
VON
WILDTYP-PROCATHEPSIN
S
UND
PROCATHEPSIN
S-N104Q
25
3.4.2.2.BIOTINYLIERUNG
VON
REIFEM
CATHEPSIN
S
25
3.5.
GEWINNUNG
DER
MEDIEN
UND
ZELLEXTRAKT
NACH
ENDOCYTOSEEXPERIMENTEN
26
3.6.
IMMUNPRAEZIPITATION
26
3.7.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
27
3.8.
AUSWERTUNG
DER
ELEKTROPHEROGRAMME
DER
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
28
3.8.1.
AUTORADIOGRAPHIE
28
3.8.2.
SILBERFAERBUNG
DER
ELEKTROPHEROGRAMME
29
3.8.3.
WESTEMBLOT
29
3.8.3.1
.AUSWERTUNG
VON
WESTEMBLOTS
MIT
FARBREAKTION
30
3.8.3.2.AUSWERTUNG
VON
WESTEMBLOTS
MIT
DEM
ECL-SYSTEM
30
3.8.3.3.
AUSWERTUNG
VON
WESTEMBLOTS
VON
BIOTINYLIERTEN
CATHEPSIN
S-FORMEN
DURCH
DAS
ECL-SYSTEM
30
3.9.
ENDOCYTOSEUNTERSUCHUNGEN
VON
[
35
S]PROCATHEPSIN
S,
[
35
S]PROCATHEPSIN
S-N104Q,
BIOTINYLIERTEM
PROCATHEPSIN
S
UND
REIFEM
CATHEPSIN
S
31
3.10.
BINDUNGSEXPERIMENTE
VON
PROCATHEPSIN
S-N
1
04Q
AN
MEMBRANEN
INTAKTER
HEK
293
-ZELLEN
31
3.11.
ZELLFRAKTIONIERUNG
3
3
3.11.1.
HERSTELLUNG
DES
POSTNUKLEAEREN
UEBERSTANDES
33
3.11.2.
PERCOLL-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
33
3.11.3.
LYSOSOMENPRAEPARATION
34
3.12.
LEITENZYMBESTIMMUNG
34
3.12.1.
BESTIMMUNG
DER
SS-HEXOSAMINIDASE
34
3.12.2.
BESTIMMUNG
DER
PHOSPHATIDYL-INOSITOL-4-KINASEAKTIVITAET
35
3.13.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
35
3.13.1.
MICROBIURETMETHODE
3
5
3.13.2.
MICRO
BCA
PROTEIN-BESTIMMUNG
36
3.14.
BESTIMMUNG
DER
TRITON
XIOO-KONZENTRATION
DURCH
FLUORIMETRIE
36
4.
ERGEBNISSE
37
4.1.
REINIGUNG
VON
NICHT
GLYCOSYLIERTEM
PROCATHEPSIN
S-N104Q
37
4.1.1.
GEWINNUNG
DES
PROCATHEPSIN
S-NL
04Q
37
4.1.2.
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
VON
PROCATHEPSIN
S-N104Q
AN
PHENYLSEPHAROSE
HILOAD
16/10
37
4.1.2.1.
VERSUCHE
ZUR
ENTFERNUNG
DES
TRITON
XI
00
AUS
DEM
PROCATHEPSIN
S-N104Q
PRAEPARAT
NACH
PHENYLSEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
39
4.1.2.2.
GELCHROMATOGRAPHIE
VON
PROCATHEPSIN
S-N104Q
NACH
PHENYLSEPHAROSE
CHROMATOGRAPHIE
AN
HILOAD
16/60
SUPERDEX
G75
42
4.1.3.
GELCHROMATOGRAPHIE
VON
PROCATHEPSIN
S-N104Q
AN
HILOAD
26/60
SUPERDEX
G75
43
4.2.
KONZENTRIERUNG
VON
PROCATHEPSIN
S-N104Q
44
4.3.
ENDOCYTOSE
VON
[
35
S]PROCATHEPSIN
S-NL04Q
DURCH
HEK
293-ZELLEN
45
4.3.1.
EINFLUSS
DER
INKUBATIONSTEMPERATUR
AUF
DIE
ENDOCYTOSE
45
4.3.2.
ABHAENGIGKEIT
DER
ENDOCYTOSE
VON
DER
INKUBATIONSZEIT
46
4.3.3.
ABHAENGIGKEIT
DER
ENDOCYTOSE
VON
DER
[
35
S]PROCATHEPSIN
S-N104Q-KONZENTRATION
49
4.4.
ENDOCYTOSE
VON
[
35
S]MARKIERTEM
PROCATHEPSIN
S-N
1
04Q
DURCH
HEK
293-ZELLEN
IN
GEGENWART
STEIGENDER
KONZENTRATIONEN
AN
NICHT
MARKIERTEM
PROCATHEPSIN
S-NL
04Q
50
4.4.1
BESTIMMUNG
DER
PROCATHEPSIN
S-N
1
04Q-KONZENTRATION
MIT
HILFE
DES
ECL-SYSTEMES
50
4.4.2.
KOMPETITIONSUNTERSUCHUNGEN
VON
[
35
S]PROCATHEPSIN
S-N
1
04Q
UND
NICHT
MARKIERTEM
PROCATHEPSIN
S-NL04Q
UM
BINDUNG
AN
EIN
MEMBRANMOTIV
51
4.5.
ENDOCYTOSE
VON
REIFEM
CATHEPSIN
S
DURCH
HEK
293-ZELLEN
54
4.6.
NACHWEIS
VON
NICHT
GLYCOSYLIERTEM
PROCATHEPSIN
S-N104Q
IN
LYSOSOMEN
56
4.7.
ULTRASTRUKTURELLE
UNTERSUCHUNG
DER
SUBZELLULAEREN
VERTEILUNG
VON
GLYCOSYLIERTEM
UND
NICHT
GLYCOSYLIERTEM
PROCATHEPSIN
S
IN
HEK
293-ZELLEN
57
4.8.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BINDUNG
VON
[
35
S]MARKIERTEM
PROCATHEPSIN
S-N104Q
AN
MEMBRANEN
VON
HEK
293-ZELLEN
60
5.
DISKUSSION
65
5.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SPEZIFITAET
DER
BINDUNG
VON
NICHT
GLYCOSYLIERTEM
PROCATHEPSIN
S-N104Q
AN
HEK
293-ZELLEN
65
5.2.
ULTRASTRUKTURELLE
UNTERSUCHUNG
ZUR
MEMBRANLOKALISATION
VON
NICHT
GLYCOSYLIERTEM
PROCATHEPSIN
S
73
5.3.
NACHWEIS
VON
POTENTIELLEN
BINDUNGSPROTEINEN
FUER
PROCATHEPSIN
S-N104Q
IN
MEMBRANEN
VON
HEK
293-ZELLEN
76
6.
SCHLUSSFOLGERUNG
85
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
86
TABELLENVERZEICHNIS
88
LITERATURVERZEICHNIS
ANHANG |
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